Los metabolits immunomodulators son una caracteristica clau del microenvironament tumoral (TME), mas amb qualques excepcions, lors identitats demòran largament desconegudas. Aquí, analisèrem de tumors e de cellulas T de las tumors e de las ascitas de pacients amb carcinòma serós de naut gra (HGSC) per revelar lo metabolòma d'aqueles diferents compartiments TME. Las ascitas e las cellulas tumoralas an de diferéncias de metabolits extensivas. Comparat amb l'ascite, las cellulas T infiltrantas en tumor son significativament enriquidas en 1-metilnicotinamida (MNA). E mai se lo nivèl de MNA dins las cellulas T es elevat, l'expression de la nicotinamida N-metiltransferasa (una enzima que cataliza lo transferiment de grops metils de S-adenosilmetionina a nicotinamida) es limitada als fibroblasts e a las cellulas tumoralas. Foncionalament, MNA indusís las cellulas T a secretar lo factor de necròsi tumoral alfa de la citoquina promotritz de la tumor. Doncas, l'AMN derivat de TME contribuís a la regulacion immunitària de las cellulas T e representa una cibla d'immunoterapia potenciala pel tractament del càncer uman.
Los metabolits derivats de la tumor pòdon aver un efièch inhibitor prigond sus l'immunitat antitumoral, e de mai en mai d'evidéncias mòstran que pòdon tanben servir de fòrça motritz clau per la progression de la malautiá (1). En mai de l'efièch Warburg, de trabalhs recents an començat per caracterizar l'estat metabolic de las cellulas tumoralas e sa relacion amb l'estat immunitari del microenvironament tumoral (TME). D'estudis sus de modèls de mirga e de cellulas T umanas an mostrat que lo metabolisme de glutamina (2), lo metabolisme oxidatiu (3) e lo metabolisme de glucòsa (4) pòdon agir independentament sus divèrses sosgrops de cellulas immunitàrias. Divèrses metabolits dins aquelas vias inibís la foncion antitumoral de las cellulas T. Es estat provat que lo blocatge del coenzima tetraidrobiopterina (BH4) pòt damatjar la proliferacion de las cellulas T, e l'aument de BH4 dins lo còrs pòt melhorar la responsa immunitària antitumoral mediada per CD4 e CD8. De mai, l'efièch immunosupressor de la kynurenina pòt èsser salvat per l'administracion de BH4 (5). Dins lo glioblastòma mutant de l'isocitrat deshidrogenasa (IDH), la secrecion d'idroxiglutarat enantiometabolic (R)-2 (R-2-HG) inhibís l'activacion, la proliferacion e l'activitat de citolisi de las cellulas T (6). Recentament, es estat mostrat que lo metilglioxal, un sosproduch de la glicolisi, es produch per de cellulas supressoras d'origina mieloïda, e lo transferiment de cellulas T de metilglioxal pòt inhibir la foncion de las cellulas T efectoras. En tractament, la neutralizacion de metilglioxal pòt superar l'activitat de las cellulas supressoras derivadas de mieloïdes (MDSC) e melhorar sinergicament la terapia de blocatge de punt de contraròtle dins de modèls de mirgas (7). Aquestes estudis soslinhan collectivament lo ròtle clau dels metabolits derivats de TME dins la regulacion de la foncion e de l'activitat de las cellulas T.
La disfoncion de las cellulas T es estada largament reportada dins lo càncer d'ovari (8). Aquò es en partida degut a las caracteristicas metabolicas inerentas a l'ipoxia e a la vasculatura tumorala anormala (9), çò que resulta dins la conversion de glucòsa e triptofan en sosproduches coma l'acid lactic e la quinurenina. Lo lactat extracellular excessiu redusís la produccion d'interferon-γ (IFN-γ) e mena la diferenciacion dels sosgrops mielosupressius (10, 11). La consomacion de triptofan inhibís dirèctament la proliferacion de cellulas T e inhibís la senhalacion dels receptors de cellulas T (12-14). Malgrat aquelas observacions, fòrça trabalh a l'entorn del metabolisme immunitari foguèt menat a tèrme en cultura de cellulas T in vitro en utilizant de mèdias optimizats, o limitat a de modèls de mirgas omològs in vivo, que cap d'eles reflècha pas plenament l'eterogeneïtat dels càncers umans e de l'environament macro e micro fisiologic.
Una caracteristica comuna del càncer d'ovari es la propagacion peritoneala e l'aparicion d'ascite. L'acumulacion de liquid cellular dins l'ascite es associada a una malautiá avançada e un pronostic marrit (15). Segon los rapòrts, aquel compartiment unic es ipoxic, a de nivèls nauts de factor de creissença endoteliala vasculara (VEGF) e d'indoleamin 2,3-dioxigenasa (IDO), e es infiltrat per de cellulas reguladoras T e de cellulas inhibitriças mieloïdas (15-18). L'environament metabolic de l'ascite pòt èsser diferent d'aquel de la quita tumor, doncas la reprogramacion de las cellulas T dins l'espaci peritoneal es pas clara. De mai, las diferéncias claus e l'eterogeneïtat entre las ascitas e los metabolits presents dins l'environament tumoral pòdon empachar l'infiltracion de las cellulas immunitàrias e lor foncion sus las tumors, e de recèrcas suplementàrias son necessàrias.
Per resòlvre aqueles problèmas, concebèrem un metòde de separacion de cellulas sensiblas e d'espectrometria de massa tandem de cromatografia liquida (LC-MS/MS) per estudiar diferents tipes de cellulas (inclusent las cellulas T CD4 + e CD8 +) e tanben dins e entre las tumors. Sos metabolits s'espandisson sus las cellulas dins lo meteis environament d'ascite e de tumor del pacient. Utilizam aqueste metòde en conjonccion amb la citometria de flux de nauta dimension e lo sequénciament d'ARN unicellulari (scRNA-seq) per provesir un retrach fòrça resolut de l'estatut metabolic d'aquelas populacions claus. Aqueste metòde revelèt un aument significatiu del nivèl de 1-metilnicotinamida (MNA) dins las cellulas T tumoralas, e d'experiéncias in vitro mostrèron que l'efièch immunomodulator de MNA sus la foncion de las cellulas T èra desconegut prèviament. En general, aqueste metòde revela las interaccions metabolicas mutualas entre las tumors e las cellulas immunitàrias, e provesís d'informacions unicas suls metabolits de regulacion immunitària, que pòdon èsser utils pel tractament de l'immunoterapia del càncer d'ovari basada sus de cellulas T.
Utilizèrem la citometria de flux de nauta dimension per quantificar a l'encòp la captacion de glucòsa [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglucòsa (2-NBDG) e l'activitat mitocondriala [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (2019, 2019) son de costat marcadors tipics que distinguisson las cellulas immunitàrias e las populacions de cellulas tumoralas (Taula S2 e Figura S1A). Aquesta analisi mostrèt que comparat amb las cellulas T, las cellulas ascitas e tumoralas an de nivèls de captacion de glucòsa mai nauts, mas an de diferéncias mai pichonas dins l'activitat mitocondriala. La captacion mejana de glucòsa de las cellulas tumoralas [CD45-EpCAM (EpCAM)+] es de tres a quatre còps la de las cellulas T, e la captacion mejana de glucòsa de las cellulas T CD4 + es 1,2 còps la de las cellulas T CD8 +, çò qu'indica que los linfocits infiltrants tumorals (TIL) an de besonhs metabolics diferents quitament dins la meteissa figura TME (Figura 1). En contraste, l'activitat mitocondriala dins las cellulas tumoralas es similara a aquela de las cellulas T CD4 +, e l'activitat mitocondriala dels dos tipes de cellulas es mai nauta qu'aquela de las cellulas T CD8 + (Figura 1B). En general, aqueles resultats revelan lo nivèl metabolic. L'activitat metabolica de las cellulas tumoralas es mai nauta qu'aquela de las cellulas T CD4 +, e l'activitat metabolica de las cellulas T CD4 + es mai nauta qu'aquela de las cellulas T CD8 + . Malgrat aqueles efièches entre los tipes de cellulas, i a pas de diferéncia coerenta dins l'estatut metabolic de las cellulas T CD4 + e CD8 + o lors proporcions relativas dins l'ascite comparada amb las tumors (Figura 1C). En contraste, dins la fraccion de cellulas CD45, la proporcion de cellulas EpCAM+ dins la tumor aumentèt comparada a l'ascite (Figura 1D). Observèrem tanben una diferéncia metabolica clara entre los compausants de las cellulas EpCAM+ e EpCAM-. Las cellulas EpCAM+ (tumoral) an una captacion de glucòsa e una activitat mitocondriala mai nauta que las cellulas EpCAM-, qu'es fòrça mai nauta que l'activitat metabolica dels fibroblasts dins las cellulas tumoralas dins TME (Figura 1, E e F).
(A e B) Intensitat de fluorescéncia mediana (MFI) de la captacion de glucòsa (2-NBDG) (A) e d'activitat mitocondriala de las cellulas T CD4 + (MitoTracker roge escur) (B) Grafics representatius (esquèrra) e donadas tabuladas (Drecha), cellulas T CD8 + e cellulas tumoralas EpCAM + CD45 coma cites tumorals. (C) Lo rapòrt de cellulas CD4 + e CD8 + (de cellulas T CD3 +) dins l'ascite e la tumor. (D) Proporcion de cellulas tumoralas EpCAM + dins l'ascite e la tumor (CD45−). (E e F) Absorpcion de glucòsa EpCAM + CD45-tumor e EpCAM-CD45-matrix (2-NBDG) (E) e activitat mitocondriala (MitoTracker roge escur) (F) grafics representatius (esquèrra) e donadas tabuladas (Drecha) Ascites e cellulas tumoralas. (G) Grafics representatius de l'expression de CD25, CD137 e PD1 per citometria de flux. (H e I) Expression CD25, CD137 e PD1 sus de cellulas T CD4 + (H) e de cellulas T CD8 + (I). (J e K) Fenotipes ingenus, de memòria centrala (Tcm), d'efector (Teff) e de memòria d'efector (Tem) basats sus l'expression de CCR7 e CD45RO. Imatges representatius (esquèrra) e donadas tabularas (drecha) de cellulas T CD4 + (J) e cellulas T CD8 + (K) dins l'ascite e las tumors. Valors de P determinadas per t-test acoblat (*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). La linha representa de pacients correspondents (n = 6). FMO, fluorescéncia mens un; MFI, intensitat de fluorescéncia mediana.
Una analisi mai prigonda revelèt d'autras diferéncias significativas entre l'estatut fenotipic de las cellulas T fòrça resoludas. La memòria activada (Figura 1, G a I) e efectora (Figura 1, J e K) dins las tumors son fòrça mai frequentas que l'ascite (proporcion de cellulas CD3 + T). De manièra similara, l'analisi del fenotipe per l'expression dels marcadors d'activacion (CD25 e CD137) e dels marcadors d'esgotament [proteïna de mòrt cellulara programada 1 (PD1)] mostrèt que malgrat que las caracteristicas metabolicas d'aquelas populacions son diferentas (Figura S1, B a E) , Mas cap de diferéncias metabolicas significativas foguèron observadas de manièra coerenta entre los efièches natius, o de memòria (Figura S1, F1). IEU). Aquestes resultats foguèron confirmats en utilizant de metòdes d'aprendissatge automatic per assignar automaticament de fenotipes cellulars (21), çò que revelèt mai la preséncia d'un grand nombre de cellulas de medula òssa (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) dins l'ascite del pacient (Figura S2A ). Demest totes los tipes de cellulas identificats, aquela populacion de cellulas mieloïdas mostrèt la captacion de glucòsa e l'activitat mitocondriala mai nauta (Figura S2, B a G). Aquestes resultats meton en evidéncia las fòrtas diferéncias metabolicas entre los tipes de cellulas multiples trobats dins las ascitas e las tumors dins los pacients HGSC.
Lo desfís principal per comprene las caracteristicas metabolomicas de TIL es la necessitat d'isolar de mòstras de cellulas T de puretat, de qualitat e de quantitat sufisentas de las tumors. D'estudis recents an mostrat que los metòdes de classament e d'enriquiment de granas basats sus la citometria de flux pòdon menar a de cambiaments dins los perfils de metabolits cellulars (22-24). Per superar aquel problèma, optimizèrem lo metòde d'enriquiment de granas per isolar e isolar TIL del càncer d'ovari uman resecat quirurgicament abans l'analisi per LC-MS/MS (veire Materials e Metòdes; Figura 2A). Per fin d'avalorar l'impacte global d'aqueste protocòl suls cambiaments de metabolits, comparèrem los perfils de metabolits de las cellulas T activadas per de donaires en bona santé après l'estapa de separacion de granas susmencionada amb de cellulas que foguèron pas separadas per de granas mas demorèron sus glaç. Aquesta analisi de contraròtle de qualitat trobèt qu'i a una correlacion nauta entre aquelas doas condicions (r = 0,77), e la repetibilitat tecnica del grop de 86 metabolits a una repetibilitat nauta (Figura 2B). Doncas, aqueles metòdes pòdon realizar una analisi precisa de metabolits dins de cellulas que subisson un enriquiment de tipe cellular, provesissent aital la primièra plataforma de nauta resolucion per identificar de metabolits especifics dins HGSC, permetent aital a las personas d'obténer una compreneson mai prigonda de l'especificitat cellulara Programa de metabolisme sexual.
(A) Diagrama esquematic d'enriquiment de granas magneticas. Abans l'analisi per LC-MS/MS, las cellulas subiràn tres torns consecutius d'enriquiment de granas magneticas o demoraràn sus glaç. (B) L'efièch del tipe d'enriquiment sus l'abondància de metabolits. La mejana de tres mesuras per cada tipe d'enriquiment ± SE. La linha grisa representa una relacion 1:1. La correlacion intraclassa (ICC) de las mesuras repetidas mostrada dins l'etiqueta de l'axe. NAD, nicotinamida adenina dinucleotid. (C) Diagrama esquematic del flux de trabalh de l'analisi dels metabolits del pacient. Las ascitas o las tumors son collectadas dels pacients e crioconservadas. Una pichona porcion de cada mòstra foguèt analizada per citometria de flux, del temps que los mòstras restants subissián tres torns d'enriquiment per de cellulas CD4+, CD8+ e CD45-. Aquestas fraccions cellularas foguèron analizadas en utilizant LC-MS/MS. (D) Mapa de calor de l'abondància normalizada de metabolits. Lo dendrograma representa l'agropament de Ward de las distàncias euclidianas entre las mòstras. (E) Analisi de compausants principals (PCA) de la mapa de metabolits de mòstra, mostrant tres replicas de cada mòstra, los mòstras del meteis pacient son connectats per una linha. (F) Lo PCA del perfil de metabolit de la mòstra condicionada sul pacient (es a dire, en utilizant una redondància parciala); lo tipe de mòstra es limitat per la còca convexa. PC1, compausant principal 1; PC2, compausant principal 2.
Aprèp, aplicam aquel metòde d'enriquiment per analisar 99 metabolits dins las fraccions de cellulas CD4 +, CD8 + e CD45 dins las ascites e las tumors primarias de sièis pacients HGSC (Figura 2C, Figura S3A e Taula S3 e S4). La populacion d'interès representa de 2% a 70% de la granda mòstra originala de cellulas vivas, e la proporcion de cellulas varia fòrça entre los pacients. Après aver separat las granas, la fraccion enriquida d'interès (CD4+, CD8+ o CD45-) representa mai de 85% de totas las cellulas vivas dins la mòstra en mejana. Aqueste metòde d'enriquiment nos permet d'analisar de populacions cellularas a partir del metabolisme dels teissuts tumorals umans, çò qu'es impossible de far a partir de grandas mòstras. En utilizant aqueste protocòl, determinèrem que la l-kinurenina e l'adenosina, aqueles dos metabolits immunosupressius plan caracterizats èran elevats dins las cellulas T tumoralas o las cellulas tumoralas (Figura S3, B e C). Doncas, aqueles resultats mòstran la fidelitat e la capacitat de nòstra tecnologia de separacion cellulara e d'espectrometria de massa per trobar de metabolits biologicament importants dins los teissuts dels pacients.
Nòstra analisi revelèt tanben una fòrta separacion metabolica dels tipes de cellulas dins e entre los pacients (Figura 2D e Figura S4A). En particular, comparat amb d'autres pacients, lo pacient 70 mostrèt de caracteristicas metabolicas diferentas (Figura 2E e Figura S4B), çò qu'indica que pòt i aver una eterogeneïtat metabolica substanciala entre los pacients. Es de notar que comparat amb d'autres pacients (1,2 a 2 litres; Taula S1), la quantitat totala d'ascites collectada dins lo pacient 70 (80 ml) èra mai pichona. Lo contraròtle de l'eterogeneïtat interpacient pendent l'analisi dels compausants principals (per exemple, en utilizant l'analisi de redondància parciala) mòstra de cambiaments coerents entre los tipes de cellulas, e los tipes de cellulas e/o lo microenvironament son clarament agregats segon lo perfil de metabolit (Figura 2F ). L'analisi de metabolits simples insistiguèt sus aqueles efièches e revelèt de diferéncias significativas entre los tipes de cellulas e lo microenvironament. Es de notar que la diferéncia mai extrèma observada es l'AMN, qu'es generalament enriquit dins de cellulas CD45- e dins de cellulas CD4+ e CD8+ qu'infiltran la tumor (Figura 3A). Per las cellulas CD4 +, aquel efièch es mai evident, e l'MNA dins las cellulas CD8 + sembla tanben èsser fòrtament afectat per l'environament. Pasmens, aquò es pas important, perque sonque tres dels sièis pacients pòdon èsser avalorats pels puntuacions CD8+ de la tumor. En mai de MNA, dins diferents tipes de cellulas dins l'ascite e las tumors, d'autres metabolits que son mal caracterizats dins la TIL son tanben rics diferencialament (Figuras S3 e S4). Doncas, aquelas donadas revelan un ensemble prometeire de metabolits immunomodulators per de recèrcas mai prigondas.
(A) Contengut normalizat de MNA dins de cellulas CD4+, CD8+ e CD45- d'ascites e de tumor. Lo grafic de bóstia mòstra la mediana (linha), l'interval interquartil (charnièra de l'encastre) e l'interval de donadas, fins a 1,5 còps l'interval interquartil (mosta de l'encastre). Coma descrich dins los Materiaus e Metòdes dels Pacients, utilizatz la valor limma del pacient per determinar la valor P (*P<0,05 e **P<0,01). (B) Diagrama esquematic del metabolisme MNA (60). Metabolits: S-adenosyl-1-metionine; SAH, S-adenosina-1-omocisteïna; NA, nicotinamida; MNA, 1-metilnicotinamida; 2-PY, 1-metil- 2-piridòna-5-carboxamida; 4-PY, 1-metil-4-piridòna-5-carboxamida; NR, nicotinamida ribòsa; NMN, mononucleotid de nicotinamida. Enzims (verd): NNMT, nicotinamida N-metiltransferasa; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamida fosforibosil transferasa; AOX1, oxidasa d'aldeïd 1; NRK, nicotinamida ribosida quinasa; NMNAT, nicotinamida mono Nucleotide adenilat transferasa; Pnp1, fosforilasa de nucleosid de purina. (C) t-SNE de scRNA-seq d'ascites (gris) e de tumor (roge; n = 3 pacients). (D) Expression de NNMT dins de populacions cellularas diferentas identificadas en utilizant scRNA-seq. (E) Expression de NNMT e AOX1 dins SK-OV-3, ren embrionari uman (HEK) 293T, cellulas T e cellulas T tractadas amb MNA. L'expression plegada es mostrada en rapòrt amb SK-OV-3. Lo modèl d'expression amb SEM es mostrat (n = 6 donaires en bona santé). Las valors de Ct mai grandas que 35 son consideradas coma indetectablas (UD). (F) Expression de SLC22A1 e SLC22A2 dins SK-OV-3, HEK293T, cellulas T e cellulas T tractadas amb 8mM MNA. L'expression plegada es mostrada en rapòrt amb SK-OV-3. Lo modèl d'expression amb SEM es mostrat (n = 6 donaires en bona santé). Las valors de Ct mai grandas que 35 son consideradas coma indetectablas (UD). (G) Contengut de MNA cellulara dins de cellulas T donairas sanas activadas après 72 oras d'incubacion amb MNA. Lo modèl d'expression amb SEM es mostrat (n = 4 donaires en bona santé).
MNA es produch en transferissent lo grop metil de S-adenosyl-1-metionina (SAM) a nicotinamida (NA) per nicotinamida N-metiltransferasa (NNMT; Figura 3B). NNMT es subreexprimit dins una varietat de càncers umans e es associat a la proliferacion, l'invasion e la metastasi (25-27). Per melhor comprene la font de MNA dins las cellulas T dins TME, utilizèrem scRNA-seq per caracterizar l'expression de NNMT a travèrs de tipes de cellulas dins las ascites e las tumors de tres pacients HGSC (Taula S5). L'analisi d'aperaquí 6 500 cellulas mostrèt que dins d'environaments d'ascita e de tumor, l'expression de NNMT èra restrencha a las populacions presumidas de fibroblasts e de cellulas tumoralas (Figura 3, C e D). Es de notar qu'i a pas cap d'expression evidenta de NNMT dins cap de populacion qu'exprimís PTPRC (CD45 +) (Figura 3D e Figura S5A), çò qu'indica que l'MNA detectat dins l'espèctre del metabolit es estat introduch dins las cellulas T. L'expression de l'aldeïd oxidasa 1 (AOX1) convertís MNA en 1-metil-2-piridòna-5-carboxamida (2-PYR) o 1-metil-4-piridòna-5-carboxamida (4-PYR); La figura 3B) es tanben restrencha a la populacion de fibroblasts qu'exprimisson COL1A1 (Figura S5A), qu'indican amassa que las cellulas T mancan de la capacitat del metabolisme MNA convencional. Lo modèl d'expression d'aqueles gèns ligats a MNA foguèt verificat en utilizant un segond ensemble de donadas cellularas independentas d'ascites de pacients HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). De mai, l'analisi quantitativa de reaccion en cadena de la polimerasa (qPCR) de cellulas T donairas sanas tractadas amb MNA mostrèt que comparada amb de cellulas tumoralas ovarianas SK-OV-3 de contraròtle, NNMT o AOX1 èra gaireben pas exprimit (Figura 3E). Aquestes resultats inesperats indican que l'MNA pòt èsser secretat de fibroblasts o de tumors dins de cellulas T adjacentas dins TME.
E mai se los candidats incluson la familha dels transportaires de cations organics 1 a 3 (OCT1, OCT2 e OCT3) codats per la familha del portaire soluble 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 e SLC22A3), los transportaires potencials de MNA son encara indefinits (28) . La QPCR d'ARNm de cellulas T donairas sanas mostrèt de nivèls d'expression bas de SLC22A1 mas de nivèls indetectables de SLC22A2, çò que confirmèt qu'èra estat raportat prèviament dins la literatura (Figura 3F) (29). En contraste, la linha cellulara de tumor ovarian SK-OV-3 exprimiguèt de nivèls nauts dels dos transportaires (Figura 3F).
Per fin de testar la possibilitat que las cellulas T ajan la capacitat d'absorbir MNA estrangièr, de cellulas T donairas sanas foguèron cultivadas pendent 72 oras en preséncia de diferentas concentracions d'MNA. En abséncia d'AMN exogèn, lo contengut cellular d'AMN pòt pas èsser detectat (Figura 3G). Pasmens, las cellulas T activadas tractadas amb MNA exogèn mostrèron un aument dependent de la dòsi del contengut MNA dins las cellulas, fins a 6 mM MNA (Figura 3G). Aqueste resultat indica que malgrat lo nivèl bas d'expression del transportaire e la manca de l'enzim principal responsable del metabolisme intracellular de MNA, TIL pòt encara prene MNA.
L'espèctre dels metabolits dins las cellulas T dels pacients e los experiments d'absorpcion de MNA in vitro aumentan la possibilitat que los fibroblasts associats al càncer (CAF) secreten MNA e que las cellulas tumoralas pòdon regular lo fenotipe e la foncion de TIL. Per determinar l'efièch de MNA sus las cellulas T, de cellulas T donairas sanas foguèron activadas in vitro en preséncia o abséncia de MNA, e lor proliferacion e produccion de citoquinas foguèron evaluadas. Après 7 jorns d'apond de MNA a la dòsi mai nauta, lo nombre de doblament de la populacion foguèt moderadament redusit, del temps que lo vigor foguèt mantengut a totas las dòsis (Figura 4A). De mai, lo tractament de MNA exogèn resultèt en un aument de la proporcion de cellulas T CD4 + e CD8 + qu'exprimisson lo factor de necròsi tumoral-α (TNFα; Figura 4B). En contraste, la produccion intracellulara d'IFN-γ foguèt significativament redusida dins las cellulas T CD4 +, mas pas dins las cellulas T CD8 +, e i aguèt pas de cambiament significatiu dins l'interleucina 2 (IL-2; Figura 4, C e D). Doncas, l'assaig immunosorbent ligat a l'enzima (ELISA) dels subrenadants d'aquelas culturas de cellulas T tractadas amb MNA mostrèt un aument significatiu de TNFα, una diminucion de IFN-γ, e pas cap de cambiament de IL-2 (Figura 4, E a G). . La diminucion de l'IFN-γ indica que l'MNA pòt jogar un ròtle dins l'inibicion de l'activitat antitumoral de las cellulas T. Per simular l'efièch de l'MNA sus la citotoxicitat mediada per de cellulas T, de cellulas quimericas del receptor d'antigèn T (FRα-CAR-T) ciblant lo receptor de folat α e de cellulas CAR-T (GFP) reguladas per de cellulas de proteïna fluorescenta verda (GFP) -CAR-T) son produsidas per de cellulas mononuclearas de sang periferica de donaires en bona santé (PBMC). Las cellulas CAR-T foguèron cultivadas pendent 24 oras en preséncia de MNA, e puèi cocultivadas amb de cellulas tumoralas ovarianas SK-OV-3 umanas exprimissent lo receptor de folat α a un rapòrt efector-cibla de 10:1. Lo tractament amb MNA resultèt en una diminucion significativa de l'activitat de tuariá de las cellulas FRα-CAR-T, qu'èra similara a las cellulas FRα-CAR-T tractadas amb adenosina (Figura 4H).
(A) Nombre total de cellulas viablas e doblament de populacion (PD) dirèctament de la cultura lo jorn 7. Lo grafic de barras representa la mejana + SEM de sièis donaires en bona santé. Representa de donadas d'almens n = 3 experiéncias independentas. (B a D) CD3/CD28 e IL-2 foguèron utilizats per activar de cellulas T a lors concentracions respectivas de MNA pendent 7 jorns. Abans l'analisi, las cellulas foguèron estimuladas amb PMA/ionomicina amb GolgiStop pendent 4 oras. Expression de TNFα (B) dins de cellulas T. Imatge d'exemple (esquèrra) e donadas tabularas (drecha) de l'expression de TNFα dins de cellulas vivas. Expression d'IFN-γ (C) e d'IL-2 (D) dins de cellulas T. L'expression de citoquinas foguèt mesurada per citometria de flux. Lo grafic de barras representa la mejana (n = 6 donaires en bona santé) + SEM. Utilizar l'analisi unidireccionala de la variança e de mesuras repetidas (*P<0,05 e **P<0,01) per determinar la valor P. Representa de donadas d'almens n = 3 experiéncias independentas. (E a G) CD3/CD28 e IL-2 foguèron utilizats per activar de cellulas T a lors concentracions respectivas de MNA pendent 7 jorns. Lo mitan foguèt collectat abans e après 4 oras d'estimulacion PMA/ionomicina. Las concentracions de TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) foguèron mesuradas per ELISA. Lo grafic de barras representa la mejana (n = 5 donaires en bona santé) + SEM. Valor P determinada en utilizant l'analisi unidireccionala de la variança e de mesuras repetidas (*P<0,05). La linha ponctuada indica lo limit de deteccion de la deteccion. (H) Ensag de lisi cellulara. Las cellulas FRα-CAR-T o GFP-CAR-T foguèron ajustadas amb adenosina (250μM) o MNA (10 mM) pendent 24 oras, o daissadas sens tractament (Ctrl). Lo percentatge de tuariá de cellulas SK-OV-3 foguèt mesurat. Valor P determinada per l'espròva t de Welch (*P<0,5 e **P<0,01).
Per fin d'obténer una compreneson mecanistica de la regulacion de l'expression TNFα dependenta de MNA, los cambiaments dins l'ARNm TNFα de las cellulas T tractadas amb MNA foguèron evaluats (Figura 5A). Las cellulas T donairas sanas tractadas amb MNA mostrèron un aument doble dels nivèls de transcripcion TNFα, çò qu'indica que MNA es dependent de la regulacion transcripcionala TNFα. Per estudiar aquel possible mecanisme de regulacion, dos factors de transcripcion coneguts que regulan TNFα, a saber lo factor nuclear de cellulas T activadas (NFAT) e la proteïna especifica 1 (Sp1), foguèron evaluats en responsa a la ligason de MNA al promotor TNFα proximal ( 30). Lo promotor TNFα conten 6 sites de ligason NFAT identificats e 2 sites de ligason Sp1, que se superpausan a un site [-55 parelhs de basas (pb) del 5'cap] (30). L'immunoprecipitacion de cromatina (ChIP) mostrèt que quand foguèt tractat amb MNA, la ligason de Sp1 al promotor TNFα aumentèt de tres còps. L'incorporacion de NFAT tanben aumentèt e s'aprochèt d'importància (Figura 5B). Aquestas donadas indican que MNA regula l'expression de TNFα a travèrs la transcripcion Sp1, e dins una mendre mesura l'expression de NFAT.
(A) Comparat amb de cellulas T cultivadas sens MNA, lo cambiament de plec de l'expression de TNFα dins de cellulas T tractadas amb MNA. Lo modèl d'expression amb SEM es mostrat (n = 5 donaires en bona santé). Representa de donadas d'almens n = 3 experiéncias independentas. (B) Lo promotor TNFα de las cellulas T tractadas amb o sens 8 mM MNA après NFAT e Sp1 foguèron combinats amb (Ctrl) e estimulacion PMA/ionomicina pendent 4 oras. L'immunoglobulina G (IgG) e H3 foguèron utilizats coma de contraròtles negatius e positius per l'immunoprecipitacion, respectivament. La quantificacion de ChIP mostrèt que la ligason de Sp1 e NFAT al promotor TNFα dins de cellulas tractadas amb MNA aumentèt divèrsas còps comparada amb lo contraròtle. Representa de donadas d'almens n = 3 experiéncias independentas. Valor P determinada per de tèsts t multiples (*** P <0,01). (C) Comparat a l'ascite de HGSC, las cellulas T (non citotoxicas) mostrèron una expression aumentada de TNF dins la tumor. Las colors representan diferents pacients. Las cellulas afichadas son estadas mostrejadas aleatòriament a 300 e tremoladas per limitar lo subredessenh (** Padj = 0,0076). (D) Modèl prepausat de MNA pel càncer d'ovari. MNA es produch dins de cellulas tumoralas e fibroblasts dins TME e es pres per de cellulas T. MNA aumenta la ligason de Sp1 al promotor TNFα, menant a una transcripcion TNFα aumentada e a la produccion de citoquinas TNFα. MNA causa tanben una diminucion de l'IFN-γ. L'inibicion de la foncion de las cellulas T mena a una capacitat de tuar redusida e a una creissença tumorala accelerada.
Segon los rapòrts, TNFα a d'efièches antitumoral e antitumoral dependents del davant e de l'esquina, mas a un ròtle plan conegut per promòure la creissença e la metastasi del càncer d'ovari (31-33). Segon los rapòrts, la concentracion de TNFα dins l'ascite e los teissuts tumorals dins los pacients amb càncer d'ovari es mai nauta qu'aquela dins los teissuts benignes (34-36). En tèrmes de mecanisme, TNFα pòt regular l'activacion, la foncion e la proliferacion dels globuls blancs, e cambiar lo fenotipe de las cellulas cancerosas (37, 38). Coerent amb aquelas descobèrtas, l'analisi d'expression genica diferenciala mostrèt que lo TNF èra significativament regulat en naut dins las cellulas T dins los teissuts tumorals comparat amb l'ascite (Figura 5C). L'aument de l'expression de TNF èra evident sonque dins de populacions de cellulas T amb un fenotipe non citotoxic (Figura S5A). En resumit, aquelas donadas sostenon l'opinion que MNA a d'efièches immunosupressius e promotors de tumors dobles dins HGSC.
L'etiquetatge fluorescent basat sus la citometria de flux es vengut lo metòde principal per estudiar lo metabolisme TIL. Aquestes estudis an mostrat que comparat amb los linfocits sanguins periferics o las cellulas T d'organs linfoïdes segondaris, los TIL murins e umans an una tendéncia mai nauta a la captacion de glucòsa (4, 39) e a la pèrda graduala de la foncion mitocondriala (19, 40). E mai s'avèm observat de resultats similars dins aqueste estudi, lo desvolopament clau es de comparar lo metabolisme de las cellulas tumoralas e TIL del meteis teissut tumoral resecat. Coerent amb qualques unes d'aqueles rapòrts precedents, las cellulas tumoralas (CD45-EpCAM +) d'ascites e de tumors an una captacion de glucòsa mai nauta que las cellulas T CD8 + e CD4 +, çò que sosten que la captacion nauta de glucòsa de las cellulas tumoralas pòt èsser comparada amb las cellulas T. Lo concèpte de competicion de cellulas T. TME. Pasmens, l'activitat mitocondriala de las cellulas tumoralas es mai nauta qu'aquela de las cellulas T CD8 +, mas l'activitat mitocondriala es similara a aquela de las cellulas T CD4 + . Aquestes resultats renfòrçan lo tèma emergent que lo metabolisme oxidatiu es important per las cellulas tumoralas (41, 42). Suggerisson tanben que las cellulas T CD8 + pòdon èsser mai susceptiblas a la disfoncion oxidativa que las cellulas T CD4 +, o que las cellulas T CD4 + pòdon utilizar de fonts de carbòni autras que la glucòsa per manténer l'activitat mitocondriala (43, 44). Cal notar qu'observèrem pas cap de diferéncia dins la captacion de glucòsa o l'activitat mitocondriala entre los efectors T CD4 +, la memòria de l'efector T e las cellulas de memòria centrala T dins l'ascite. De manièra similara, l'estat de diferenciacion de las cellulas T CD8 + dins las tumors a pas res a veire amb los cambiaments dins la captacion de glucòsa, çò que met en evidéncia la diferéncia significativa entre las cellulas T cultivadas in vitro e TIL uman in vivo (22). Aquelas observacions foguèron tanben confirmadas per l'utilizacion d'una assignacion automatica imparciala de populacion cellulara, que revelèt mai que las cellulas CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + amb una captacion de glucòsa e una activitat mitocondriala mai elevadas que las cellulas tumoralas son prevalentas mas an una populacion cellulara activa metabolica. Aquesta populacion pòt representar la sospopulacion putativa de cellulas supressoras mieloïdas o de cellulas dendriticas plasmacitoïdas identificadas dins l'analisi scRNA-seq. E mai se los dos son estats reportats dins de tumors ovarianas umanas [45], an encara besonh. Un trabalh suplementari es per descriure aquela sospopulacion mieloïda.
E mai se los metòdes basats sus la citometria de flux pòdon esclarir las diferéncias generalas de glucòsa e de metabolisme oxidatiu entre tipes de cellulas, los metabolits precises produches per la glucòsa o d'autras fonts de carbòni pel metabolisme mitocondrial dins TME son pas encara estats determinats. Assignar la preséncia o l'abséncia de metabolits a un sosensems TIL donat demanda la purificacion de la populacion cellulara del teissut excisat. Doncas, nòstre metòde d'enriquiment cellular combinat amb l'espectrometria de massa pòt provesir d'informacions suls metabolits que son enriquits de manièra diferenciala dins las populacions de cellulas T e de cellulas tumoralas dins de mòstras de pacients correspondentas. E mai s'aqueste metòde a d'avantatges sul triatge de cellulas activadas per la fluorescéncia, certanas bibliotècas de metabolits pòdon èsser afectadas a causa de l'estabilitat inerenta e/o del taus de rotacion rapid (22). Pasmens, nòstre metòde foguèt capable d'identificar dos metabolits immunosupressius reconeguts, l'adenosina e la kynurenina, perque varian fòrça entre los tipes de mòstra.
Nòstra analisi metabolomica de las tumors e dels sostipes TIL provesís mai d'informacions sul ròtle dels metabolits dins la TME ovariana. D'en primièr, en utilizant la citometria de flux, determinèrem qu'i aviá pas cap de diferéncia dins l'activitat mitocondriala entre las tumors e las cellulas CD4 + T. Pasmens, l'analisi LC-MS/MS revelèt de cambiaments significatius dins l'abondància de metabolits demest aquelas populacions, çò qu'indica que las conclusions sul metabolisme TIL e son activitat metabolica globala demandan una interpretacion atentiva. En segond luòc, MNA es lo metabolit amb la diferéncia mai granda entre las cellulas CD45 e las cellulas T dins l'ascite, pas las tumors. Doncas, la compartimentacion e l'emplaçament de la tumor pòdon aver d'efièches diferents sul metabolisme TIL, çò que met en evidéncia l'eterogeneïtat possibla dins un microenvironament donat. En tresen luòc, l'expression de l'enzim productor de MNA NNMT es subretot limitada a CAF, qu'es de cellulas tumoralas dins una mesura mendra, mas de nivèls de MNA detectables son observats dins de cellulas T derivadas de tumor. La subreexpression de NNMT dins la CAF ovariana a un efièch conegut que favoriza lo càncer, en partida a causa de la promocion del metabolisme de la CAF, de l'invasion tumorala e de la metastasi (27). E mai se lo nivèl global de TIL es moderat, l'expression de NNMT dins CAF es estrechament ligada al sostipe mesenquimal Cancer Genome Atlas (TCGA), qu'es associat a un pronostic marrit (27, 46, 47). Fin finala, l'expression de l'enzim AOX1 responsable de la degradacion de MNA es tanben limitada a la populacion CAF, çò qu'indica que las cellulas T mancan de la capacitat de metabolizar MNA. Aquestes resultats sostenon l'idèa que malgrat que cal mai de trabalh per verificar aquela descobèrta, de nivèls nauts d'MNA dins las cellulas T pòdon indicar la preséncia d'un microenvironament CAF immunosupressiu.
Donat lo nivèl d'expression bas dels transportaires de MNA e los nivèls indetectables de proteïnas claus implicadas dins lo metabolisme de MNA, la preséncia de MNA dins las cellulas T es inesperada. Ni NNMT ni AOX1 poguèron èsser detectats per l'analisi scRNA-seq e la qPCR ciblada de doas còrtas independentas. Aquestes resultats indican que l'MNA es pas sintetizat per de cellulas T, mas absorbit de la TME environanta. Los experiments in vitro mòstran que las cellulas T an tendéncia a acumular MNA exogèn.
Nòstres estudis in vitro an mostrat que l'AMN exogèn indusís l'expression de TNFα dins las cellulas T e melhora la ligason de Sp1 al promotor TNFα. E mai se TNFα a de foncions antitumoralas e antitumoralas, dins lo càncer d'ovari, TNFα pòt promòure la creissença del càncer d'ovari (31-33). La neutralizacion de TNFα dins la cultura de cellulas tumoralas ovarianas o l'eliminacion del senhal TNFα dins de modèls de mirgas pòdon melhorar la produccion de citoquinas inflamatòrias mediadas per TNFα e inhibir la creissença tumorala (32, 35). Doncas, dins aquel cas, l'MNA derivat de TME pòt agir coma un metabolit proinflamatòri a travèrs un mecanisme dependent de TNFα a travèrs lo bucle autocrin, en favorisant aital l'aparicion e la propagacion del càncer d'ovari (31). En foncion d'aquela possibilitat, lo blocatge TNFα es estudiat coma un agent terapeutic potencial pel càncer d'ovari (37, 48, 49). De mai, MNA altera la citotoxicitat de las cellulas CAR-T a las cellulas tumoralas ovarianas, provesissent d'autras pròvas per la supression immunitària mediada per MNA. Collectivament, aqueles resultats suggerís un modèl que las tumors e las cellulas CAF secretan MNA dins TME extracellular. A travèrs (i) l'estimulacion de la creissença del càncer d'ovari inducha per TNF e (ii) l'inibicion de l'activitat citotoxica de cellulas T inducha per MNA, aquò pòt aver un efièch tumoral doble (Figura 5D).
En conclusion, en aplicant una combinason d'enriquiment cellular rapid, de sequénciament de cellula unica e de perfilatge metabolic, aquel estudi revelèt las diferéncias immunometabolomicas enòrmas entre las tumors e las cellulas d'ascite dins los pacients HGSC. Aquesta analisi completa mostrèt que i a de diferéncias dins la captacion de glucòsa e l'activitat mitocondriala entre las cellulas T, e identifiquèt MNA coma un metabolit regulator immunitari autonòm non cellular. Aquestas donadas an un impacte sus cossí TME afecta lo metabolisme de las cellulas T dins los càncers umans. E mai se la competicion dirècta pels nutriments entre las cellulas T e las cellulas cancerosas es estada reportada, los metabolits pòdon tanben agir coma de regulators indirèctes per promòure la progression tumorala e eventualament suprimir las responsas immunitàrias endogènas. La descripcion suplementària del ròtle foncional d'aqueles metabolits regulators pòt dobrir d'estrategias alternativas per melhorar la responsa immunitària antitumorala.
Los exemplars de pacients e las donadas clinicas foguèron obtenguts a travèrs lo depaus de teissut tumoral del càncer BC certificat per la Ret de Depaus de Teissut Canadian. Segon lo protocòl aprovat pel Comitat d'Etica de la Recèrca del Cancèr de BC e l'Universitat de Colómbia Britanica (H07-00463), totes los exemplars e las donadas clinicas dels pacients obtenguèron un consentiment escrich informat o renoncièron formalament a lor consentiment. Las mòstras son emmagazinadas dins la BioBank certificada (BRC-00290). Las caracteristicas detalhadas dels pacients son mostradas dins las taulas S1 e S5. Per la criopreservacion, un bisturí es utilizat per descompausar mecanicament la mòstra de tumor del pacient e puèi l'empontar a travèrs un filtre de 100 microns per obténer una suspension de cellula unica. L'ascite del pacient foguèt centrifugada a 1500 rpm pendent 10 minutas a 4°C per pelletar las cellulas e levar lo subrenatant. Las cellulas obtengudas de tumor e d'ascites foguèron criopreservadas dins 50% de sèrum AB uman inactivat per calor (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) e 10% de sulfoxid de dimetil. Aquestas suspensions de cellula unica conservadas foguèron descongeladas e utilizadas per la metabolomica e la determinacion de metabolits descrichas çai-jos.
Lo mitan complet consistís en 0,22 μm filtrat 50:50 complementat RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) complementat amb 10% de sèrum AB uman inactivat per calor (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) x1 Solucion de penicilina estreptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) e 50 μMB-mercaptoetanòl. AimV (Invitrogen) es complementat amb 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) e 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). Lo tampon de coloracion del citomètre de flux consistissiá en 0,22 μm de salina tamponada amb fosfat filtrat (PBS; Invitrogen) complementada amb 3% de sèrum uman AB inactivat per calor (Sigma). Lo tampon d'enriquiment cellular es compausat de 0,22 μm de PBS filtrat e complementat amb 0,5% de sèrum AB uman inactivat per calor (Sigma-Aldrich).
Dins un mitan complet a 37°C, las cellulas foguèron coloradas amb 10 nM MT DR e 100 μM 2-NBDG pendent 30 minutas. Puèi, las cellulas foguèron coloradas amb de colorant de viabilitat eF506 a 4°C pendent 15 minutas. Ressuspendre las cellulas dins FC Block (eBioscience) e Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluir dins un tampon de coloracion del citomètre de flux (segon las instruccions del fabricant), e incubar pendent 10 minutas a temperatura ambienta. Coloratz las cellulas amb un ensemble d'anticòrs (taula S2) dins un tampon de coloracion de citometria de flux a 4°C pendent 20 minutas. Ressuspendre las cellulas dins un tampon de coloracion de citometria de flux (Cytek Aurora; configuracion 3L-16V-14B-8R) abans l'analisi. Utilizatz SpectroFlo e FlowJo V10 per analisar las donadas de compte de cellulas, e utilizatz GraphPad Prism 8 per crear las donadas. L'intensitat de fluorescéncia mediana (MFI) de 2-NBDG e MT DR foguèt log-normalizada, e puèi un tèst t acoblat foguèt utilizat per l'analisi estatistica per prene en compte los pacients correspondents. Suprimir totas las populacions amb mens de 40 eveniments de l'analisi; picatz una valor MFI de 1 per totas las valors negativas abans de realizar l'analisi estatistica e la visualizacion de donadas.
Per complementar l'estrategia de portada manuala del panèl de procès susmencionat, utilizèrem l'anotacion completa per l'arbre de restriccion de forma (FAUST) (21) per assignar automaticament de cellulas a la populacion après aver eliminat de cellulas mòrtas dins FlowJo. Gestionam manualament la sortida per fusionar de populacions que semblan èsser mal assignadas (en combinant PD1+ amb de cellulas tumoralas PD1) e de populacions retengudas. Cada mòstra conten una mejana de mai de 2% de cellulas, per un total de 11 populacions.
La centrifugacion de densitat de gradient de Ficoll foguèt utilizada per separar PBMC dels produches de separacion de leucocits (STEMCELL Technologies). Las cellulas T CD8 + foguèron isoladas de PBMC en utilizant de CD8 MicroBeads (Miltenyi) e espandidas dins un mitan complet en utilizant TransAct (Miltenyi) pendent 2 setmanas segon las instruccions del fabricant. Las cellulas foguèron daissadas demorar pendent 5 jorns dins un mitan complet contenent IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), e puèi reestimuladas amb TransAct. Lo jorn 7, segon las instruccions del fabricant, de MicroBeads CD45 umans (Miltenyi) foguèron utilizats per enriquir las cellulas en tres torns consecutius. Las cellulas foguèron aliquotadas per l'analisi de citometria de flux (coma descrich çai-sus), e un milion de cellulas foguèron aliquotadas tres còps per l'analisi LC-MS/MS. Los mòstras foguèron tractats per LC-MS/MS coma descrich çai-jos. Estimèrem la valor de metabolit mancant amb un nombre d'ions de 1000. Cada mòstra es normalizada pel nombre total d'ions (TIC), convertida logaritmicament e normalizada automaticament dins MetaboAnalystR abans l'analisi.
La suspension de cellula unica de cada pacient foguèt descongelada e filtrada a travèrs un filtre de 40 μm dins un mitan complet (coma descrich çai-sus). Segon lo protocòl del fabricant, tres torns consecutius de seleccion positiva per separacion magnetica de perlas en utilizant MicroBeads (Miltenyi) foguèron utilizats per enriquir las mòstras per las cellulas CD8+, CD4+ e CD45- (sus glaç). En resumit, las cellulas son resuspendudas dins un tampon d'enriquiment cellular (coma descrich çai-sus) e comptadas. Las cellulas foguèron incubadas amb de perlas CD8 umanas, de perlas CD4 umanas o de perlas CD45 umanas (Miltenyi) a 4°C pendent 15 minutas, e puèi lavadas amb un tampon d'enriquiment cellular. La mòstra es passada a travèrs la colomna LS (Miltenyi), e las fraccions positivas e negativas son collectadas. Per reduire la durada e maximizar l'estapa de recuperacion cellulara, la fraccion CD8 es alara utilizada pel segond torn d'enriquiment CD4+, e la fraccion CD4 es utilizada per l'enriquiment CD45 seguent. Mantenètz la solucion sus glaç pendent tot lo procès de separacion.
Per preparar de mòstras per l'analisi de metabolits, las cellulas foguèron lavadas un còp amb una solucion de sal glaçada, e 1 ml de metanòl a 80% foguèt apondut a cada mòstra, puèi vortexada e congelada dins l'azòt liquid. Los mòstras foguèron someses a tres cicles de congelacion-descongelacion e centrifugats a 14 000 rpm pendent 15 minutas a 4°C. Lo subrenadant que conten los metabolits es evaporat fins a sec. Los metabolits foguèron tornats dissoldre dins 50 μl d'acid formic a 0,03%, vortexats per mesclar, e puèi centrifugats per levar los escombres.
Extraire los metabolits coma descrich çai-sus. Transferir lo subrenadant dins una botelha de cromatografia liquida de nauta performància per la recèrca metabolomica. Utilizar un protocòl de tractament aleatòri per tractar cada mòstra amb un nombre similar de cellulas per prevenir d'efièches de lots. Faguèrem una avaloracion qualitativa dels metabolits globals publicada prèviament sul AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). L'analisi cromatografica e l'integracion de l'airal de pic foguèron realizadas en utilizant lo logicial MultiQuant version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Un compte d'ions de 1000 foguèt utilizat per estimar la valor de metabolit mancant, e lo TIC de cada mòstra foguèt utilizat per calcular l'airal de pic normalizat de cada metabolit detectat per corregir los cambiaments introduches per l'analisi instrumentala del tractament de mòstra. Après que TIC es normalizat, MetaboAnalystR(51) (paramètre per defaut) es utilizat per la conversion logaritmica e l'escalament automatic de la linha de nòrma. Utilizèrem PCA amb paquet R vegan per realizar una analisi exploratòria de las diferéncias del metabolòma entre los tipes de mòstra, e utilizèrem l'analisi de redondància parciala per analisar los pacients. Utilizar lo metòde Ward per construire un dendrograma de mapa de calor per agropar la distància euclidiana entre los mòstras. Utilizèrem limma (52) sus l'abondància de metabolits estandardizadas per identificar de metabolits diferencialament abondants dins tot lo tipe cellular e lo microenvironament. Per simplificar l'explicacion, utilizam lo paramètre mejana del grop per especificar lo modèl, e consideram los tipes de cellulas dins lo microenvironament coma cada grop (n = 6 grops); pel tèst de significacion, faguèrem tres mesuras repetidas per cada metabolit Per evitar una falsa replicacion, lo pacient foguèt inclus coma un obstacle dins lo dessenh de limma. Per fin de verificar las diferéncias de metabolits entre diferents pacients, ajustèrem lo modèl limma inclusent de pacients d'un biais fix. Raportam la significacion del contraste preespecificat entre lo tipe cellular e lo microenvironament de Padj <0,05 (correccion Benjamini-Hochberg).
Après l'enriquiment de vigor en utilizant lo kit de supression de cellulas mòrtas Miltenyi (>80% de viabilitat), lo sequenciatge de transcriptòma monocellulari foguèt realizat sus las mòstras totalas d'ascites geladas vivas e de tumors en utilizant un protocòl d'expression de gèns 10x 5′. Cinc cases amb de tumors e d'ascites correspondents foguèron analizats, e mai se la viabilitat bassa d'una mòstra de tumor empachava son inclusion. Per obténer de seleccions multiplas de pacients, combinèrem las mòstras de cada pacient dins las vias del contrarotlaire de cròm 10x, e analizèrem los sites d'ascite e de tumor separadament. Après sequenciatge [Illumina HiSeq 4000 28×98 pb extrèm acoblat (PE), genòma de Quebèc; una mejana de 73 488 e 41 378 lecturas per cellula per tumor e ascites respectivament]], utilizèrem CellSNP e Vireo (53) (basat sus CellSNP coma Lo SNP uman comun (VCF) provesit per GRCh38 es assignat una identitat de donaire. Utilizam SNPRelate per inferir l'identitat mai pròcha (IBS) del genotipe dels pacients (IBS) exclusent las cellulas non assignadas e las cellulas identificadas coma de duplexes e de donaires correspondents entre las mòstras d'ascites e de tumors (54). (2792 e 4183 cellulas de tumor e d'ascites, respectivament) per l'analisi Utilizam l'agropament de Louvain (57) basat sus la distància de Jaccard a las cellulas de cluster per expression. las cellulas son definidas per l'expression de CD8A e GZMA, exclusent los sosgrops amb una expression de proteïna ribosomica bassa.
Los PBMC foguèron separats dels produches de separacion de leucocits (STEMCELL Technologies) per centrifugacion de densitat de gradient de Ficoll. Las cellulas CD3 + foguèron isoladas de PBMC en utilizant de perlas CD3 (Miltenyi). En preséncia o abséncia de MNA, las cellulas CD3+ foguèron activadas amb CD3 ligat a la placa (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleucina). Lo darrièr jorn d'expansion, la viabilitat (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) e la proliferacion (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) foguèron evaluadas per citometria de flux. Avalorar la foncion de l'efector en estimulant de cellulas amb PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1μg/ml) amb GolgiStop pendent 4 oras, e susvelhar CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) e TNFα-fluoresce isothianato (TCMA-1) (TCb1) BD). Estimular las cellulas qPCR e ChIP amb PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1μg/ml) pendent 4 oras. Lo subrenadant ELISA foguèt collectat abans e après l'estimulacion amb PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) pendent 4 oras.
Seguissètz lo protocòl del fabricant per isolar l'ARN en utilizant lo RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Utilizatz QIAshredder (QIAGEN) per omogeneizar la mòstra. Utilizar un kit d'ARN a cDNA de nauta capacitat (Thermo Fisher Scientific) per sintetizar l'ADN complementari (cDNA). Utilizatz TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) per quantificar l'expression genica (segon lo protocòl del fabricant) amb las sondas seguentas: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042755m15S (AOX1), Hs02786624_g1 [gliceraldeïd-3-fosfat fòra d'idrogèn (GAPDH)] e Hs01010726_m1 (SLC22A2). Los mòstras foguèron executats sul sistèma de PCR en temps real StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) dins la placa de reaccion optica rapida de 96 potz MicroAmp (Applied Biosystems) amb un filme optic MicroAmp. Tota valor de Ct que despassa 35 es considerada coma al dessús del lindal de deteccion e es marcada coma indetectable.
Realizar ChIP coma descrich prèviament (58). En resumit, las cellulas foguèron tractadas amb de formaldeïd (concentracion finala 1,42%) e incubadas a temperatura ambienta pendent 10 minutas. Utilizar un tampon d'inflamacion suplementat (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl e 0,1% NP-40) sus glaç pendent 10 minutas, puèi resuspendre dins un tampon d'immunoprecipitacion coma descrich (58 ). Lo mòstra foguèt alara sonicat amb los cicles seguents: 10 cicles (20 impulses de 1 segonda) e un temps estatic de 40 segondas. Incubar los anticòrs d'immunoglobulina G de gra ChIP (Tecnologia de senhalament cellulara; 1μl), d'istòna H3 (Tecnologia de senhalament cellulara; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) e SP1 (Tecnologia de senhalament cellulara; 3μl) amb la mòstra a 4°CC de trebolament tota la nuèch. Incubar de perlas de proteïna A (Thermo Fisher Scientific) amb la mòstra a 4°C amb un tremolament doç pendent 1 ora, puèi utilizar de perlas de chelex (Bio-Rad) per enriquir l'ADN, e utilizar la proteinasa K (Thermo Fisher) per la digestion de las proteïnas. Lo promotor TNFα foguèt detectat per PCR: endavant, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; al contrari, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produch de 207 bp). Los imatges foguèron produches per Image Lab (Bio-Rad) e quantificats en utilizant lo logicial ImageJ.
Lo subrenadant de cultura cellulara foguèt collectat coma descrich çai-sus. La determinacion foguèt realizada segon los procediments del fabricant del kit ELISA TNFα uman (Invitrogen), del kit ELISA IL-2 uman (Invitrogen) e del kit ELISA IFN-γ uman (Abcam). Segon lo protocòl del fabricant, lo subrenadant foguèt diluit 1:100 per detectar TNFα e IL-2, e 1:3 per detectar IFN-γ. Utilizatz EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) per mesurar l'absorbància a 450 nm.
Los PBMC foguèron separats dels produches de separacion de leucocits (STEMCELL Technologies) per centrifugacion de densitat de gradient de Ficoll. Las cellulas CD3 + foguèron isoladas de PBMC en utilizant de perlas CD3 (Miltenyi). En preséncia o abséncia de MNA, las cellulas CD3+ foguèron activadas amb CD3 ligat a la placa (5μg/ml), CD28 soluble (3μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleucina) pendent 3 jorns. Après 3 jorns, las cellulas foguèron collectadas e lavadas amb 0,9% de salina, e lo pellet foguèt congelat. Lo compte de cellulas foguèt realizat per citometria de flux (Cytek Aurora; configuracion 3L-16V-14B-8R) en utilizant 123count eBeads.
Extraire los metabolits coma descrich çai-sus. L'extrach sec foguèt reconstituit a una concentracion de 4000 equivalents cellulars/μl. Analisar la mòstra per cromatografia en fasa invèrsa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e colomna CORTECS T3 (2,1×150 mm, talha de particula 1,6-μm, talha de pòr 120-Å; #186008500, Waters). Espectromètre de massa polar (6470, Agilent), que l'ionizacion per electrospray fonciona en mòde positiu. La fasa mobila A es 0,1% d'acid formic (en H2O), la fasa mobila B es de 90% d'acetonitril, 0,1% d'acid formic. Lo gradient LC es de 0 a 2 minutas per 100% A, de 2 a 7,1 minutas per 99% B, e de 7,1 a 8 minutas per 99% B. Puèi tornatz equilibrar la colomna amb la fasa mobila A a un debit de 0,6 ml/min pendent 3 minutas. . Lo debit es de 0,4ml/min, e la cambra de colomna es caufada a 50°C. Utilizatz l'estandard quimic pur de MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canadà) per establir lo temps de retencion (RT) e la transformacion (RT = 0,882 minutas, transformacion 1 = 137→94,1, transformacion 2 = 137→92 , Conversion = 13→777). Quand las tres transicions se produson al temps de retencion corrècte, la transicion 1 es utilizada per la quantificacion per assegurar l'especificitat. La corba estandard de MNA (Toronto Research Chemical Company) foguèt generada per sièis dilucions en sèria de la solucion de stock (1 mg/ml) per obténer d'estandards de 0,1, 1,0, 10 e 100 ng/ml e 1,0 e 10 μg/ml respectivament liquid. Lo limit de deteccion es 1 ng/ml, e la responsa lineara es entre 10 ng/ml e 10μg/ml. Cada injeccion de dos microlitres de mòstra e d'estandard es utilizada per l'analisi LC/MS, e una mòstra de contraròtle de qualitat mixta es executada cada uèch injeccions per assegurar l'estabilitat de la plataforma d'analisi. Las responsas MNA de totas las mòstras de cellulas tractadas amb MNA èran dins la gamma lineara de l'assaig. L'analisi de donadas foguèt facha en utilizant lo logicial d'analisi quantitativa MassHunter (v9.0, Agilent).
Lo construct αFR-CAR de segonda generacion foguèt pres de Song et al. (59). En resumit, lo construct conten los contenguts seguents: sequéncia de cap CD8a, fragment de variabla de cadena unica especifica a l'αFR uman, charnièra CD8a e region transmembrana, domeni intracellular CD27 e domeni intracellular CD3z. La sequéncia CAR completa foguèt sintetizada per GenScript, e puèi clonada dins lo vector d'expression lentivirala de segonda generacion en amont de la casseta d'expression GFP utilizada per avalorar l'eficiéncia de transduccion.
Lo lentivirus es produch per transfeccion de cellulas HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); cultivat dins lo mitan Eagle modificat de Dulbecco que conten 10% de sèrum bovin fetal (FBS) e 1% de PenStrep, e utilizat lo vector CAR-GFP e Los plasmids d'embalatge (psPAX2 e pMD2.G, Addgene) utilizan l'amina de lipofeccion (Sigma-Aldrich). Lo subrenadant que conten de virus foguèt collectat 48 e 72 oras après la transfeccion, filtrat e concentrat per ultracentrifugacion. Conservar lo subrenadant viral concentrat a -80°C fins a la transduccion.
Los PBMC son separats dels produches de separacion de leucocits de donaires sans (STEMCELL Technologies) per centrifugacion de densitat de gradient de Ficoll. Utilizar de microperlas CD8 de seleccion positiva (Miltenyi) per isolar de cellulas CD8+ de PBMC. Estimular las cellulas T amb TransAct (Miltenyi) e dins lo mitan TexMACS [Miltenyi; complementat amb 3% de sèrum uman inactivat per calor, 1% de PenStrep e IL-2 (300 U/ml)]. Vint-e-quatre oras après l'estimulacion, las cellulas T foguèron transdusidas amb de lentivirus (10 μl de subrenatant de virus concentrat per 106 cellulas). 1 a 3 jorns après la transduccion sus Cytek Aurora (sus FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), avalorar l'expression GFP de las cellulas per demostrar una eficiéncia de transduccion d'almens 30% .
Las cellulas CAR-T foguèron cultivadas pendent 24 oras dins Immunocult (STEMCELL Technologies; complementada amb 1% PenStrep) jos las condicions seguentas: non tractadas, tractadas amb 250 μM d'adenosina o 10 mM MNA. Après pretractament, las cellulas CAR-T foguèron lavadas amb PBS e combinadas amb 20 000 cellulas SK-OV-3 [ATCC; dins lo mitan McCoy 5A (Sigma-Aldrich) complementat amb 10% FBS e 1% PenStrep a 10: Lo rapòrt efector-cibla de 1 foguèt amplificat en triplicat dins un mitan Immunocult complementat. Las cellulas SK-OV-3 e las cellulas SK-OV-3 lisadas amb de saponina digitalis (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) foguèron utilizadas coma de contraròtles negatius e positius, respectivament. Après 24 oras de cocultivacion, lo subrenadant foguèt collectat e la lactato desidrogenasa (LDH) foguèt mesurada segon las instruccions del fabricant (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Lo subrenadant LDH foguèt diluit 1:50 dins un tampon LDH. Lo percentatge de tuatge foguèt mesurat en utilizant la formula seguenta: percentatge de tuatge = percentatge de correccion / taus maximal de tuatge x 100%, ont percentatge de correccion = co-cultura-cellulas T solament, e taus maximal de tuatge = contraròtle positiu-contròl negatiu.
Coma descrich dins lo tèxte o los materials e los metòdes, utilizatz GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 per l'analisi estatistica. Se de mòstras multiplas son collectadas del meteis pacient (coma l'ascite e la tumor), utilizam un tèst t acoblat o inclusèm lo pacient coma un efièch aleatòri dins un modèl linear o generalizat segon lo cas. Per l'analisi metabolomica, lo tèst d'importància es realizat en triplicat.
Per de materials suplementaris per aqueste article, mercés de consultar http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
S'agís d'un article d'accès dobèrt distribuit jos las condicions de la licéncia d'atribucion non comerciala Creative Commons , que permet l'usatge, la distribucion e la reproduccion dins quin mèdia que siá, tant que l'usatge final es pas per un profièch comercial e que la premissa es que l'òbra originala es corrècta. Referéncia.
Nòta : Vos demandam pas que de provesir vòstra adreça de corrièl per que la persona que recomandatz a la pagina sàpia que volètz que veja lo corrièl e qu'es pas de spam. Capturarem pas cap d'adreça de corrièl.
Aquesta question es utilizada per testar se sètz un visitor e evitar la somission automatica de spam.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephherson (R.R.R.Bellson), Dephardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA contribuís a la supression immunitària de las cellulas T e representa una cibla d'immunoterapia potenciala pel tractament del càncer uman.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephherson (R.R.R.Bellson), Dephardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA contribuís a la supression immunitària de las cellulas T e representa una cibla d'immunoterapia potenciala pel tractament del càncer uman.
©2021 Associacion Americana per l'Avançament de la Sciéncia. totes los dreches reservats. AAAS es un socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.