L'acid propiònic (PPA), un agent antifongic e additiu alimentari comun, es estat mostrat per causar un neurodesvolopament anormal dins de mirgas acompanhats d'una disfoncion gastrointestinala, que pòt èsser causada per una disbiòsi intestinala. Un ligam entre l'exposicion dietetica a la PPA e la disbiòsi de la microbiòta intestinala es estat suggerit, mas es pas estat dirèctament estudiat. Aquí, investiguèrem los cambiaments associats a la PPA dins la composicion del microbiota intestinal que pòdon menar a la disbiòsi. Los microbiòmas intestinals de mirgas noiridas amb una dièta non tractada (n=9) e una dièta enriquida amb PPA (n=13) foguèron sequenciats en utilizant un sequenciatge metagenomic de longa portada per avalorar las diferéncias dins la composicion microbiana e las vias metabolicas bacterianas. La PPA dietetica èra associada a un aument de l'abondància de taxons significatius, dont divèrsas espècias de Bacteroides, Prevotella e Ruminococcus, que de membres son estats implicats prèviament dins la produccion de PPA. Los microbiòmas de mirgas expausadas a PPA avián tanben mai de vias ligadas al metabolisme lipidic e a la biosintèsi d'ormonas esteroïdas. Nòstres resultats indican que la PPA pòt alterar la microbiòta intestinala e sas vias metabolicas associadas. Aquestes cambiaments observats soslinhan que los conservants classats coma segurs per la consomacion pòdon influenciar la composicion del microbiòta intestinal e, a lor torn, la santat umana. D'entre eles, P, G o S es seleccionat segon lo nivèl de classificacion que s'analisa. Per minimizar l'impacte de las classificacions falsas positivas, un lindal d'abondància relativa minimala de 1e-4 (1/10 000 lecturas) foguèt adoptat. Abans l'analisi estatistica, las abondàncias relativas reportadas per Bracken (fraction_total_reads) foguèron transformadas en utilizant la transformacion de rapòrt log centrat (CLR) (Aitchison, 1982). Lo metòde CLR foguèt causit per la transformacion de donadas perque es invariant a l'escala e sufisent per d'ensembles de donadas non escasses (Gloor et al., 2017). La transformacion CLR utiliza lo logaritme natural. Las donadas de compte reportadas per Bracken foguèron normalizadas en utilizant l'expression log relativa (RLE) (Anders e Huber, 2010). Las figuras foguèron generadas en utilizant una combinason de matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 e de logaritmes sequencials (Gloor et al., 2017). 0,12,2 e stantanotations v. 0,5,0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Lo rapòrt Bacillus/Bacteroidetes foguèt calculat per cada mòstra en utilizant de comptes de bacterias normalizats. Las valors reportadas dins las taulas son arrodonidas a 4 decimalas. L'indici de diversitat Simpson foguèt calculat en utilizant l'escript alpha_diversity.py provesit dins lo paquet KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Lo rapòrt Bracken es provesit dins l'escript e l'indici Simpson "Si" es provesit pel paramètre -an. De diferéncias significativas d'abondància foguèron definidas coma de diferéncias mejanas de CLR ≥ 1 o ≤ -1. Una diferéncia CLR mejana de ±1 indica un aument de 2,7 còps de l'abondància d'un tipe de mòstra. Lo signe (+/-) indica se lo taxon es mai abondant dins la mòstra PPA e la mòstra de contraròtle, respectivament. La significacion foguèt determinada en utilizant lo tèst U de Mann-Whitney (Virtanen et al., 2020). Statsmodels v. 0.14 (Benjamini e Hochberg, 1995; Seabold e Perktold, 2010) foguèt utilizat, e lo procediment Benjamini-Hochberg foguèt aplicat per corregir los tèsts multiples. Una valor p ajustada ≤ 0,05 foguèt utilizada coma lindal per determinar la significacion estatistica.
Lo microbiòma uman es sovent nomenat "lo darrièr organ del còrs" e jòga un ròtle vital dins la santat umana (Baquero e Nombela, 2012). En particular, lo microbiòma intestinal es reconegut per son influéncia e son ròtle dins l'ensems del sistèma dins fòrça foncions essencialas. Los bactèris comensals son abondants dins l'intestin, ocupant de niches ecologics multiples, utilizant de nutriments, e concurrissent amb de patogèns potencials (Jandhyala et al., 2015). De compausants bacterians divèrses del microbiòta intestinal son capables de produire de nutriments essencials coma de vitaminas e de promòure la digestion (Rowland et al., 2018). Los metabolits bacterians an tanben mostrat per influenciar lo desvolopament dels teissuts e melhorar las vias metabolicas e immunitàrias (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). La composicion del microbiòma intestinal uman es extrèmament divèrsa e depend de factors genetics e environamentals coma la dièta, lo genre, los medicaments e l'estat de santat (Kumbhare et al., 2019).
La dièta mairala es un compausant critic del desvolopament fetal e neonatal e una font putativa de compausats que pòdon influenciar lo desvolopament (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Un d'aqueles compausats d'interès es l'acid propionic (PPA), un sosproduch d'acid gras de cadena corta obtengut de la fermentacion bacteriana e un additiu alimentari (den Besten et al., 2013). Lo PPA a de proprietats antibacterianas e antifongicas e es doncas utilizat coma conservator alimentari e dins d'aplicacions industrialas per inhibir la creissença de mòtle e bacteriana (Wemmenhove et al., 2016). PPA a d'efièches diferents dins de teissuts diferents. Dins lo fetge, la PPA a d'efièches antiinflamatòris en afectant l'expression de citoquinas dins los macrofags (Kawasoe et al., 2022). Aquel efièch regulator es tanben estat observat dins d'autras cellulas immunitàrias, menant a una desregulacion de l'inflamacion (Haase et al., 2021). Pasmens, l'efièch contrari es estat observat dins lo cervèl. D'estudis precedents an mostrat que l'exposicion a PPA indusís un comportament similar a l'autisme dins las mirgas (El-Ansary et al., 2012). D'autres estudis an mostrat que la PPA pòt induire la gliòsi e activar de vias proinflamatòrias dins lo cervèl (Abdelli et al., 2019). Perque lo PPA es un acid feble, pòt difusar a travèrs l'epiteli intestinal dins lo torrent sanguin e aital traversar de barrèras restrictivas inclusent la barrèra sang-cervèl e tanben la placenta (Stinson et al., 2019), en soslinhant l'importància del PPA coma metabolit regulator produsit per de bacterias. E mai se lo ròtle potencial de la PPA coma factor de risc per l'autisme es actualament en cors d'enquèsta, sos efièches sus d'individús amb autisme pòdon s'estendre al delà de l'induccion de la diferenciacion neuronala.
Los simptòmas gastrointestinals coma la diarrèa e la constipacion son comuns dins los pacients amb de desòrdres neurodesvolopament (Cao et al., 2021). D'estudis precedents an mostrat que lo microbiòma dels pacients amb de desòrdres de l'espèctre autista (TEA) diferís d'aquel dels individús en bona santé, çò que suggerís la preséncia de disbiòsi de la microbiota intestinala (Finegold et al., 2010). De manièra similara, las caracteristicas del microbiòma dels pacients amb de malautiás inflamatòrias intestinalas, obesitat, malautiá d'Alzheimer, etc. diferís tanben d'aquelas d'individús en bona santé (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Pasmens, fins ara, cap de relacion causala es pas estada establida entre lo microbiòma intestinal e las malautiás o simptòmas neurologics (Yap et al., 2021), e mai se se pensa que divèrsas espècias bacterianas jògan un ròtle dins qualques unes d'aqueles estats de malautiá. Per exemple, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio e d'autres genres son mai abondants dins la microbiòta dels pacients amb autisme (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Notadament, las espècias membres de qualques unes d'aqueles genres son conegudas per possedir de gèns associats a la produccion de PPA (Reichardt et al., 2014; Yun e Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur e Dürre, 2023). Donadas las proprietats antimicrobianas de PPA, aumentar son abondància pòt èsser benefic per la creissença de bacterias productoras de PPA (Jacobson et al., 2018). Atal, un environament ric en PFA pòt menar a de cambiaments dins la microbiota intestinala, inclusent los patogèns gastrointestinals, que pòdon èsser de factors potencials menant a de simptòmas gastrointestinals.
Una question centrala dins la recèrca del microbiòma es se las diferéncias dins la composicion microbiana son una causa o un simptòma de malautiás sosjacentas. Lo primièr pas cap a elucidar la relacion complèxa entre la dièta, lo microbiòma intestinal, e las malautiás neurologicas es d'avalorar los efièches de la dièta sus la composicion microbiana. A aquel fin, utilizèrem un sequenciatge metagenomic de longa lectura per comparar los microbiòmas intestinals de la descendéncia de mirgas noiridas d'una dièta rica en PPA o esgotada en PPA. La progenitura èra noirida de la meteissa dièta que lors maires. Ipotèsiam qu'una dièta rica en PPA resultariá en de cambiaments dins la composicion microbiana intestinala e las vias foncionalas microbianas, particularament aquelas ligadas al metabolisme de PPA e/o a la produccion de PPA.
Aqueste estudi utilizèt de mirgas transgènas FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) que subreexprimisson la proteïna fluorescenta verda (GFP) jos lo contraròtle del promotor GFAP especific a la glia en seguida de las directivas del Comitat Institucional de Suènh e Utilizacion dels Animals de l'Universitat de Florida Centrala (UCIA-CU) (UFC) Nombre de permés: PROTO202000002). Après lo desmamament, las mirgas foguèron lotjadas individualament dins de gàbias amb 1-5 mirgas de cada sèxe per gàbia. Las mirgas foguèron noiridas ad libitum amb siá una dièta de contraròtle purificada (dièta estandard de etiqueta dobèrta modificada, 16 kcal% de graissa) siá amb una dièta estandard de etiqueta dobèrta modificada, 16 kcal% de graissa, contenent 5 000 ppm de propionat de sòdi). La quantitat de propionat de sòdi utilizada èra equivalenta a 5 000 mg de PFA/kg de pes alimentari total. Aquò's la concentracion mai nauta de PPA aprovada per l'utilizacion coma conservant alimentari. Per se preparar a aquel estudi, de mirgas parents foguèron noiridas amb las doas diètas pendent 4 setmanas abans l'acoblament e contunhèron pendent tota la grossessa del barratge. De ratons descendents [22 ratons, 9 contraròtles (6 mascles, 3 femèlas) e 13 PPA (4 mascles, 9 femèlas)] foguèron desmamats e puèi contunhèron amb la meteissa dièta que los barratges pendent 5 meses. De ratons descendents foguèron sacrificats a 5 meses d'edat e lor contengut fecal intestinal foguèt collectat e inicialament emmagazinat dins de tubs de microcentrifuga de 1,5 ml a -20°C e puèi transferits dins un congelador de -80°C fins que l'ADN de l'òste foguèsse esgotat e que los acids nucleics microbians foguèron extraches.
L'ADN de l'òste foguèt levat segon un protocòl modificat (Charalampous et al., 2019). Brevament, los contenguts fecals foguèron transferits a 500 μl d'InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) e emmagazinats congelats. Trabalhar un maximum de 1-2 pellets fecals per extraccion. Lo contengut fecal foguèt alara omogeneizat mecanicament en utilizant un piston de plastic dins lo tub per formar una pasta. Centrifugar los mòstras a 10 000 RCF pendent 5 min o fins que los mòstras sián granulats, puèi aspirar lo subrenadant e resuspendre lo granulat dins 250 μl 1× PBS. Ajustar 250 μl de solucion de saponina a 4,4% (TCI, numèro de produch S0019) a la mòstra coma detergent per desliurar las membranas cellularas eucariòtas. Los mòstras foguèron doçament mesclats fins a èsser lis e incubats a temperatura ambienta pendent 10 min. Puèi, per perturbar las cellulas eucariotas, 350 μl d'aiga sens nucleasa foguèron apondudas a la mòstra, incubadas pendent 30 s, e puèi 12 μl de NaCl 5 M foguèron apondudas. Los mòstras foguèron alara centrifugats a 6000 RCF pendent 5 min. Aspirar lo subrenadant e resuspendre lo pellet dins 100 μl 1X PBS. Per levar l'ADN de l'òste, apondètz 100 μl de tampon HL-SAN (12,8568 g de NaCl, 4 ml de MgCl2 1M, 36 ml d'aiga sens nucleasa) e 10 μl d'enzim HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Los mòstras foguèron mesclats a fons per pipetat e incubats a 37 °C pendent 30 min a 800 rpm sus un Eppendorf™ ThermoMixer C. Après incubacion, centrifugats a 6000 RCF pendent 3 min e lavats dos còps amb 800 μl e 1000 μl X PBS. Fin finala, tornatz suspendre lo pellet dins 100 μl 1X PBS.
L'ADN bacterian total foguèt isolat en utilizant lo New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). Lo procediment d'explotacion estandard provesit amb lo kit es leugièrament modificat. Incubar e manténer l'aiga sens nucleasa a 60°C abans l'operacion per l'elucion finala. Ajustar 10 μl de proteïnasa K e 3 μl d'ARNasa A a cada mòstra. Puèi apondètz 100 μl de tampon de lisi cellulara e mesclatz doçament. Los mòstras foguèron alara incubats dins un EppendorfTM ThermoMixer C a 56°C e 1400 rpm pendent al mens 1 ora e fins a 3 oras. Las mòstras incubadas foguèron centrifugadas a 12 000 RCF pendent 3 minutas e lo subrenadant de cada mòstra foguèt transferit dins un tub de microcentrifuga separat de 1,5 mL que conteniá 400 μL de solucion de ligason. Los tubs foguèron alara vortexats a pols pendent 5-10 segondas a d'intervals de 1 segonda. Transferir lo contengut entièr de liquid de cada mòstra (aperaquí 600–700 μL) dins un cartucho de filtre plaçat dins un tub de collecta de flux. Los tubs foguèron centrifugats a 1000 RCF pendent 3 minutas per permetre la ligason iniciala de l'ADN e puèi centrifugats a 12000 RCF pendent 1 minuta per levar lo liquid residual. La colomna de mòstra foguèt transferida dins un novèl tub de collecta e puèi lavada dos còps. Pel primièr lavatge, apondètz 500 μL de tampon de lavatge a cada tub. Invertir lo tub 3-5 còps e centrifugar puèi a 12 000 RCF pendent 1 minuta. Escartar lo liquid del tub de collecta e plaçar lo cartucho de filtre de nòu dins lo meteis tub de collecta. Pel segond lavatge, apondètz 500 μL de tampon de lavatge al filtre sens inversar. Los mòstras foguèron centrifugats a 12 000 RCF pendent 1 minuta. Transferir lo filtre dins un tub LoBind® de 1,5 mL e apondre 100 μL d'aiga sens nucleasa preescalfada. Los filtres foguèron incubats a temperatura ambienta pendent 1 minuta e puèi centrifugats a 12 000 RCF pendent 1 minuta. L'ADN eluit foguèt emmagazinat a -80°C.
La concentracion d'ADN foguèt quantificada en utilizant un fluoròmetre QubitTM 4.0. L'ADN foguèt preparat en utilizant lo QubitTM 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Cat. No. Q33231) segon las instruccions del fabricant. La distribucion de la longor del fragment d'ADN foguèt mesurada en utilizant una AglientTM 4150 o 4200 TapeStation. L'ADN foguèt preparat en utilizant de reactius d'ADN genomic AgilentTM (Cat. No. 5067-5366) e de benda d'ecran de l'ADN genomic (Cat. No. 5067-5365). La preparacion de la bibliotèca foguèt realizada en utilizant lo kit de codificacion de barras de PCR rapida Oxford Nanopore TechnologiesTM (ONT) (SQK-RPB004) segon las instruccions del fabricant. L'ADN foguèt sequenciat en utilizant un sequenciador ONT GridIONTM Mk1 amb una cellula de flux Min106D (R 9.4.1). Los paramètres de sequénciament èran: crida de basa de nauta precision, valor q minimala de 9, configuracion del còde de barras, e retalh de còde de barras. Los mòstras foguèron sequénciats pendent 72 oras, après que las donadas d'apèl de basa foguèron somesas per un tractament e una analisi ulteriors.
Lo tractament de la bioinformatica foguèt realizat en utilizant de metòdes descriches prèviament (Greenman et al., 2024). Los fichièrs FASTQ obtenguts del sequenciatge foguèron devesits en repertòris per cada mòstra. Abans l'analisi bioinformatica, las donadas foguèron tractadas en utilizant lo pipeline seguent: primièr, los fichièrs FASTQ dels mòstras foguèron fusionats dins un sol fichièr FASTQ. Puèi, las lecturas mai cortas que 1000 pb foguèron filtradas en utilizant Filtlong v. 0.2.1, amb lo sol paramètre cambiat essent –min_length 1000 (Wick, 2024). Abans de filtrar suplementari, la qualitat de lectura foguèt contrarotlada en utilizant NanoPlot v. 1.41.3 amb los paramètres seguents: –fastq –plots dot –N50 -o
Per la classificacion taxonomica, las lecturas e los contigs assemblats foguèron classats en utilizant Kraken2 v. 2.1.2 ( Wood et al., 2019 ). Generar de rapòrts e de fichièrs de sortida per las lecturas e los assemblatges, respectivament. Utilizatz l'opcion –use-names per analisar las lecturas e los assemblatges. Las opcions –gzip-compressed e –paired son especificadas pels segments de lectura. L'abondància relativa de taxons dins los metagenòmas foguèt estimada en utilizant Bracken v. 2.8 ( Lu et al., 2017 ). Creèrem d'en primièr una basa de donadas kmer contenent 1000 basas en utilizant bracken-build amb los paramètres seguents : -d
L'anotacion dels gèns e l'estimacion de l'abondància relativa foguèron realizadas en utilizant una version modificada del protocòl descrich per Maranga et al. (Maranga et al., 2023). D'en primièr, de contigs mai corts que 500 pb foguèron levats de totes los assemblatges en utilizant SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Los ensembles seleccionats foguèron alara combinats dins un pan-metegènòma. Los quadres de lectura dobèrts (ORFs) foguèron identificats en utilizant Prodigal v. 1.0.1 (una version parallèla de Prodigal v. 2.6.3) amb los paramètres seguents: -d
Los gèns foguèron d'en primièr agropats segon los identificants d'ortòleg (KO) de l'Enciclopèdia de Kyoto dels Gèns e dels Genòmas (KEGG) assignats per eggNOG per comparar las abondàncias de la via de gèns. Los gèns sens eliminacions o los gèns amb de eliminacions multiplas foguèron levats abans l'analisi. L'abondància mejana de cada KO per mòstra foguèt alara calculada e l'analisi estatistica foguèt realizada. Los gèns del metabolisme PPA foguèron definits coma quin gèn que siá qu'èra assignat una linha ko00640 dins la colomna KEGG_Pathway, çò qu'indica un ròtle dins lo metabolisme del propionat segon KEGG. Los gèns identificats coma associats a la produccion de PPA son listats dins lo tablèu suplementari 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). De tèsts de permutacion foguèron realizats per identificar los gèns de metabolisme e de produccion de PPA qu'èran significativament mai abondants dins cada tipe de mòstra. Mil permutacions foguèron realizadas per cada gèn analizat. Una valor p de 0,05 foguèt utilizada coma talh per determinar la significacion estatistica. Las anotacions foncionalas foguèron assignadas a de gèns individuals dins un amassa en foncion de las anotacions de gèns representatius dins l'amassa. Los taxons associats amb lo metabolisme de PPA e/o la produccion de PPA poirián èsser identificats en correspondent d'ID de contig dins los fichièrs de sortida de Kraken2 amb los meteisses ID de contig retenguts pendent l'anotacion foncionala en utilizant eggNOG. Los tèsts de significacion foguèron realizats en utilizant lo tèst U de Mann-Whitney descrich prèviament. La correccion per de tèsts multiples foguèt realizada en utilizant lo procediment Benjamini-Hochberg. Una valor p de ≤ 0,05 foguèt utilizada coma talh per determinar la significacion estatistica.
La diversitat del microbiòma intestinal de las mirgas foguèt avalorada en utilizant l'indici de diversitat Simpson. Cap de diferéncias significativas foguèron observadas entre los mòstras de contraròtle e PPA en tèrmes de diversitat de genre e d'espècia (valor-p pel genre: 0,18, valor-p per las espècias: 0,16) (Figura 1). La composicion microbiana foguèt alara comparada en utilizant l'analisi dels compausants principals (ACP). La figura 2 mòstra l'agropament de las mòstras per lors filums, çò qu'indica que i aviá de diferéncias dins la composicion d'espècia dels microbiòmas entre las mòstras PPA e de contraròtle. Aqueste agropament èra mens prononciat al nivèl del genre, çò que suggerís que PPA afecta cèrtas bacterias (Fig. 1 suplementària).
Figura 1. Diversitat alfa dels genres e de la composicion d'espècias del microbiòma de l'intestin de la mirga. Grafics de bóstia mostrant d'indicis de diversitat Simpson dels genres (A) e d'espècias (B) dins de PPA e de mòstras de contraròtle. La significacion foguèt determinada en utilizant lo tèst Mann-Whitney U, e la correccion multipla foguèt realizada en utilizant lo procediment Benjamini-Hochberg. ns, la valor p èra pas significativa (p>0,05).
Figura 2. Resultats de l'analisi dels compausants principals de la composicion del microbiòma de l'intestin de la mirga al nivèl de l'espècia. Lo grafic d'analisi dels compausants principals aficha la distribucion dels mòstras a travèrs lors dos primièrs compausants principals. Las colors indican lo tipe de mòstra: las mirgas expausadas a PPA son violetas e las mirgas de contraròtle son jaunas. Los compausants principals 1 e 2 son traçats sus l'axe x e l'axe y, respectivament, e son exprimits coma lor rapòrt de variança explicat.
En utilizant de donadas de compte transformats per RLE, una diminucion significativa del rapòrt median Bacteroidetes/Bacilli foguèt observada dins de mirgas de contraròtle e PPA (contraròtle: 9,66, PPA: 3,02; valor p = 0,0011). Aquesta diferéncia èra deguda a una abondància mai nauta de Bacteroidetes dins de mirgas PPA comparadas als contraròtles, e mai se la diferéncia èra pas significativa (CLR mejana de contraròtle: 5,51, CLR mejana PPA: 6,62; valor-p = 0,054), del temps que l'abondància de Bacteroidetes èra similara (CLR mejana de contraròtle: 7,76, P-value: p-value: 0,054). = 0,18).
L'analisi de l'abondància de membres taxonomics del microbiòma intestinal revelèt que 1 filum e 77 espècias diferián significativament entre PPA e mòstras de contraròtle (Taula suplementària 2). L'abondància de 59 espècias dins los mòstras de PPA èra significativament mai nauta qu'aquela dels mòstras de contraròtle, del temps que l'abondància de sonque 16 espècias dins los mòstras de contraròtle èra mai nauta que la dels mòstras de PPA (Figura 3).
Figura 3. Abondància diferenciala de taxons dins lo microbiòma intestinal de PPA e de mirgas de contraròtle. Los grafics de volcans mòstran de diferéncias dins l'abondància de genres (A) o d'espècias (B) entre las mòstras de PPA e de contraròtle. Los punts grises indican pas cap de diferéncia significativa dins l'abondància dels taxons. Los punts colorats indican de diferéncias significativas d'abondància (valor-p ≤ 0,05). Los 20 taxons màgers amb las diferéncias mai grandas d'abondància entre los tipes de mòstras son mostrats en roge e blau clar (mòstras de contraròtle e PPA), respectivament. Los punts jaunes e violets èran al mens 2,7 còps mai abondants dins los mòstras de contraròtle o PPA que dins los contraròtles. Los punts negres representan de taxons amb d'abondàncias significativament diferentas, amb de diferéncias mejanas de CLR entre -1 e 1. Las valors P foguèron calculadas en utilizant lo tèst Mann-Whitney U e corregidas per de tèsts multiples en utilizant lo procediment Benjamini-Hochberg. Las diferéncias mejanas de CLR en gras indican de diferéncias significativas d'abondància.
Après aver analisat la composicion microbiana intestinala, faguèrem una anotacion foncionala del microbiòma. Après aver filtrat de gèns de bassa qualitat, un total de 378 355 gèns unics foguèron identificats dins totes los mòstras. L'abondància transformada d'aqueles gèns foguèt utilizada per l'analisi de compausants principals (PCA), e los resultats mostrèron un naut gra d'agropament de tipes de mòstras en foncion de lors perfils foncionals (Figura 4).
Figura 4. Resultats de PCA en utilizant lo perfil foncional del microbiòma de l'intestin de la mirga. Lo grafic PCA aficha la distribucion dels mòstras a travèrs lors dos primièrs compausants principals. Las colors indican lo tipe de mòstra: las mirgas expausadas a PPA son violetas e las mirgas de contraròtle son jaunas. Los compausants principals 1 e 2 son traçats sus l'axe x e l'axe y, respectivament, e son exprimits coma lor rapòrt de variança explicat.
En seguida examinèrem l'abondància de nocauts KEGG dins diferents tipes de mòstras. Un total de 3648 knockouts unics foguèron identificats, que 196 èran significativament mai abondants dins las mòstras de contraròtle e 106 èran mai abondants dins las mòstras de PPA (Figura 5). Un total de 145 gèns foguèron detectats dins de mòstras de contraròtle e 61 gèns dins de mòstras de PPA, amb d'abondàncias significativament diferentas. Las vias ligadas al metabolisme dels lipids e dels aminosucres èran significativament mai enriquidas dins las mòstras de PPA (Taula suplementària 3). Las vias ligadas al metabolisme d'azòt e als sistèmas de relais de sofre èran significativament mai enriquidas dins las mòstras de contraròtle (Taula suplementària 3). L'abondància de gèns ligats al metabolisme de l'aminosucre/nucleotid (ko:K21279) e del metabolisme de l'inositol fosfat (ko:K07291) èra significativament mai nauta dins las mòstras de PPA (Figura 5). Los mòstras de contraròtle avián significativament mai de gèns ligats al metabolisme del benzoat (ko:K22270), al metabolisme de l'azòt (ko:K00368), e a la glicolisi/gluconeogenèsi (ko:K00131) ( Figura 5 ).
Fig. 5. Abondància diferenciala de KOs dins lo microbiòma intestinal de PPA e de mirgas de contraròtle. Lo grafic del volcan representa las diferéncias dins l'abondància dels grops foncionals (KOs). Los punts grises indican de KOs que lor abondància èra pas significativament diferenta entre los tipes de mòstra (valor-p > 0,05). Los punts colorats indican de diferéncias significativas d'abondància (valor-p ≤ 0,05). Los 20 KOs amb las diferéncias mai grandas d'abondància entre los tipes de mòstras son mostrats en roge e blau clar, correspondent als mòstras de contraròtle e PPA, respectivament. Los punts jaunes e violets indican de KOs qu'èran al mens 2,7 còps mai abondants dins las mòstras de contraròtle e PPA, respectivament. Los punts negres indican de KOs amb d'abondàncias significativament diferentas, amb de diferéncias mejanas de CLR entre -1 e 1. Las valors P foguèron calculadas en utilizant lo tèst Mann-Whitney U e ajustadas per de comparasons multiplas en utilizant lo procediment Benjamini-Hochberg. NaN indica que lo KO aparten pas a un camin dins KEGG. Las valors de diferéncia CLR mejanas en gras indican de diferéncias significativas d'abondància. Per d'informacions detalhadas sus las vias a las qualas apartenon los KOs listats, veire lo tablèu suplementari 3.
Demest los gèns anotats, 1601 gèns avián d'abondàncias significativament diferentas entre los tipes de mòstra (p ≤ 0,05), amb cada gèn essent al mens 2,7 còps mai abondant. D'aqueles gèns, 4 gèns èran mai abondants dins las mòstras de contraròtle e 1597 gèns èran mai abondants dins las mòstras PPA. Perque lo PPA a de proprietats antimicrobianas, examinèrem las abondàncias de gèns de metabolisme e de produccion de PPA entre los tipes de mòstras. D'entre los 1332 gèns ligats al metabolisme PPA, 27 gèns èran significativament mai abondants dins las mòstras de contraròtle e 12 gèns èran mai abondants dins las mòstras de PPA. D'entre los 223 gèns ligats a la produccion de PPA, 1 gèn èra significativament mai abondant dins las mòstras de PPA. La figura 6A mòstra mai l'abondància mai nauta de gèns implicats dins lo metabolisme de PPA, amb una abondància significativament mai nauta dins las mòstras de contraròtle e de grandas talhas d'efièch, del temps que la figura 6B met en evidéncia de gèns individuals amb una abondància significativament mai nauta observada dins las mòstras de PPA.
Fig. 6. Abondància diferenciala de gèns ligats a la PPA dins lo microbiòma de l'intestin de la mirga. Los grafics de volcans representan las diferéncias dins l'abondància de gèns associats al metabolisme de PPA (A) e a la produccion de PPA (B). Los punts grises indican de gèns que lor abondància èra pas significativament diferenta entre los tipes de mòstra (valor-p > 0,05). Los punts colorats indican de diferéncias significativas d'abondància (valor-p ≤ 0,05). Los 20 gèns amb las diferéncias mai grandas d'abondància son mostrats en roge e blau clar (mòstras de contraròtle e PPA), respectivament. L'abondància de punts jaunes e violets èra al mens 2,7 còps mai granda dins las mòstras de contraròtle e PPA que dins las mòstras de contraròtle. Los punts negres representan de gèns amb d'abondàncias significativament diferentas, amb de diferéncias mejanas de CLR entre -1 e 1. Las valors P foguèron calculadas en utilizant lo tèst Mann-Whitney U e corregidas per de comparasons multiplas en utilizant lo procediment Benjamini-Hochberg. Los gèns correspondon a de gèns representatius dins lo catalòg de gèns non redondants. Los noms de gèns consistisson del simbòl KEGG que denota un gèn KO. Las diferéncias CLR mejanas en gras indican d'abondàncias significativament diferentas. Un trach (-) indica qu'i a pas de simbòl pel gèn dins la basa de donadas KEGG.
Los taxons amb de gèns ligats al metabolisme e/o a la produccion de PPA foguèron identificats en correspondent l'identitat taxonomica dels contigs amb l'ID contig del gèn. Al nivèl del genre, 130 genres foguèron trobats per aver de gèns ligats al metabolisme de PPA e 61 genres foguèron trobats per aver de gèns ligats a la produccion de PPA (Taula suplementària 4). Pasmens, cap de genre mostrèt pas de diferéncias significativas d'abondància (p > 0,05).
Al nivèl de las espècias, 144 espècias bacterianas foguèron trobadas aver de gèns associats al metabolisme de PPA e 68 espècias bacterianas foguèron trobadas aver de gèns associats a la produccion de PPA (Taula suplementària 5). D'entre los metabolizaires de PPA, uèch bacterias mostrèron d'aumentacions significativas d'abondància entre los tipes de mòstra, e totas mostrèron de cambiaments significatius d'efièch (Taula suplementària 6). Totes los metabolizators de PPA identificats amb de diferéncias significativas d'abondància èran mai abondants dins las mòstras de PPA. La classificacion al nivèl d'espècia revelèt de representants de genres que diferián pas significativament entre los tipes de mòstra, inclusent divèrsas espècias de Bacteroides e Ruminococcus, e tanben Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus, e Alcaligenes polymorpha. D'entre las bacterias productoras de PPA, quatre bacterias mostrèron de diferéncias significativas d'abondància entre los tipes de mòstra. Las espècias amb de diferéncias significativas d'abondància inclusián Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis, e Ruminococcus bovis.
Dins aqueste estudi, examinèrem los efièches de l'exposicion a PPA sus la microbiòta intestinala de las mirgas. Lo PPA pòt provocar de responsas diferentas dins los bactèris perque es produsit per cèrtas espècias, utilizat coma font de noiridura per d'autras espècias, o a d'efièches antimicrobians. Doncas, son apond a l'environament intestinal via la suplementacion alimentària pòt aver d'efièches diferents segon la tolerància, la susceptibilitat e la capacitat de l'utilizar coma font de nutriments. Las espècias bacterianas sensiblas pòdon èsser eliminadas e remplaçadas per aquelas que son mai resistentas a la PPA o capablas de l'utilizar coma font alimentària, menant a de cambiaments dins la composicion de la microbiòta intestinala. Nòstres resultats revelèron de diferéncias significativas dins la composicion microbiana mas pas cap d'efièch sus la diversitat microbiana globala. Los efièches mai grands foguèron observats al nivèl de l'espècia, amb mai de 70 taxons significativament diferents en abondància entre PPA e mòstras de contraròtle (Taula suplementària 2). Una avaloracion suplementària de la composicion de las mòstras expausadas a PPA revelèt una eterogeneïtat mai granda d'espècias microbianas comparadas als mòstras non expausadas, çò que suggerís que PPA pòt melhorar las caracteristicas de creissença bacteriana e limitar las populacions bacterianas que pòdon subreviure dins d'environaments rics en PPA. Atal, PPA pòt induire selectivament de cambiaments puslèu que de causar una perturbacion generalizada de la diversitat de la microbiòta intestinala.
Los conservants alimentaris coma lo PPA an mostrat prèviament per alterar l'abondància de compausants del microbiòma intestinal sens afectar la diversitat globala (Nagpal et al., 2021). Aquí, observèrem las diferéncias mai marcantas entre las espècias Bacteroidetes dins lo filum Bacteroidetes (conegut abans coma Bacteroidetes), qu'èran significativament enriquidas dins de mirgas expausadas a PPA. L'abondància aumentada d'espècias Bacteroides es associada a una degradacion aumentada del moc, çò que pòt aumentar lo risc d'infeccion e promòure l'inflamacion (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Un estudi trobèt que de mirgas masclas neonatalas tractadas amb Bacteroides fragilis expausavan de comportaments socials que remembravan lo desòrdre de l'espèctre autista (TEA) (Carmel et al., 2023), e d'autres estudis an mostrat que las espècias de Bacteroides pòdon alterar l'activitat immunitària e menar a una cardiopatia inflamatòria autoimmune (G-C-ruupatia et al., 2023). 2019). Las espècias apartenent als genres Ruminococcus, Prevotella, e Parabacteroides foguèron tanben significativament aumentadas dins las mirgas expausadas a PPA (Coretti et al., 2018). Certanas espècias de Ruminococcus son associadas a de malautiás coma la malautiá de Crohn a travèrs la produccion de citoquinas proinflamatòrias (Henke et al., 2019), del temps que d'espècias de Prevotella coma Prevotella humani son associadas a de malautiás metabolicas coma l'ipertension e la sensibilitat a l'insulina (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Fin finala, trobèrem que lo rapòrt de Bacteroidetes (coneguts abans coma Firmicutes) a Bacteroidetes èra significativament mai bas dins las mirgas expausadas a PPA que dins las mirgas de contraròtle a causa d'una abondància totala mai nauta d'espècias Bacteroidetes. Aqueste rapòrt s'es mostrat prèviament coma un indicator important de l'omeostasi intestinala, e de perturbacions dins aquel rapòrt son estats associats a divèrses estats de malautiá (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), inclusent de malautiás inflamatòrias intestinalas (Stojanov et al., 2020). Collectivament, las espècias del filum Bacteroidetes semblan èsser mai fòrtament afectadas per un PPA alimentari elevat. Aquò pòt èsser degut a una tolerància mai nauta a la PPA o a la capacitat d'utilizar la PPA coma font d'energia, çò qu'es estat mostrat verai per al mens una espècia, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativament, l'exposicion mairala a PPA pòt melhorar lo desvolopament fetal en rendent l'intestin de la descendéncia de mirga mai susceptible a la colonizacion de Bacteroidetes; pasmens, nòstre dessenh d'estudi permetèt pas una tala avaloracion.
L'avaloracion del contengut metagenomic revelèt de diferéncias significativas dins l'abondància de gèns associats al metabolisme e a la produccion de PPA, amb de mirgas expausadas a PPA qu'expausavan una abondància mai nauta de gèns responsables de la produccion de PPA, alara que de mirgas non expausadas a PPA mostrèron una abondància mai nauta de gèns responsables del metabolisme PAA (Figura 6). Aquestes resultats suggerís que l'efièch de PPA sus la composicion microbiana pòt pas èsser unicament degut a son usatge, autrament l'abondància de gèns associats al metabolisme de PPA auriá degut mostrar una abondància mai nauta dins lo microbiòma intestinal de mirgas expausadas a PPA. Una explicacion es que PPA media l'abondància bacteriana subretot a travèrs sos efièches antimicrobians puslèu qu'a travèrs son usatge per de bacterias coma nutriment. D'estudis precedents an mostrat que PPA inhibís la creissença de Salmonella Typhimurium d'un biais dependent de la dòsi (Jacobson et al., 2018). L'exposicion a de concentracions mai nautas de PPA pòt seleccionar de bacterias que son resistentas a sas proprietats antimicrobianas e pòdon pas necessàriament èsser capablas de la metabolizar o de la produire. Per exemple, divèrsas espècias de Parabacteroides mostrèron una abondància significativament mai nauta dins de mòstras de PPA, mas cap de gèn ligat al metabolisme o a la produccion de PPA foguèt pas detectat (Taulas suplementàrias 2, 4 e 5). De mai, la produccion de PPA coma sosproduch de fermentacion es largament distribuida entre divèrsas bacterias (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Una diversitat bacteriana mai nauta pòt èsser la rason de l'abondància mai nauta de gèns ligats al metabolisme PPA dins las mòstras de contraròtle (Averina et al., 2020). De mai, sonque 27 (2,14%) de 1332 gèns èran prevists per èsser de gèns associats exclusivament al metabolisme PPA. Fòrça gèns associats al metabolisme PPA son tanben implicats dins d'autras vias metabolicas. Aquò demòstra mai que l'abondància de gèns implicats dins lo metabolisme PPA èra mai nauta dins los mòstras de contraròtle; aqueles gèns pòdon foncionar dins de vias que resultan pas en utilizacion o formacion de PPA coma sosproduch. Dins aquel cas, sonque un gèn associat a la generacion de PPA mostrèt de diferéncias significativas d'abondància entre los tipes de mòstra. Al contrari dels gèns associats al metabolisme de PPA, de gèns marcaires per la produccion de PPA foguèron seleccionats perque son dirèctament implicats dins la via bacteriana per la produccion de PPA. Dins de mirgas expausadas a PPA, totas las espècias foguèron trobadas aver una abondància e una capacitat de produire PPA significativament aumentadas. Aquò sosten la prediccion que los PPA seleccionarián de productors de PPA e doncas predison que la capacitat de produccion de PPA aumentariá. Pasmens, l'abondància de gèns correla pas necessàriament amb l'expression de gèns; aital, e mai se l'abondància de gèns associats al metabolisme PPA es mai nauta dins las mòstras de contraròtle, lo taus d'expression pòt èsser diferent (Shi et al., 2014). Per confirmar la relacion entre la prevaléncia dels gèns productors de PPA e la produccion de PPA, d'estudis de l'expression dels gèns implicats dins la produccion de PPA son necessaris.
L'anotacion foncionala dels metagenòmas PPA e de contraròtle revelèt qualques diferéncias. L'analisi PCA del contengut de gèns revelèt d'amassas discrètas entre las mòstras de PPA e de contraròtle (Figura 5). L'agropament dins la mòstra revelèt que lo contengut de gèns de contraròtle èra mai divèrs, del temps que los mòstras PPA s'agropavan amassa. L'agropament per contengut de gèns èra comparable a l'agropament per composicion d'espècia. Atal, las diferéncias dins l'abondància de la via son coerentas amb los cambiaments dins l'abondància d'espècias e de socas especificas dins eles. Dins de mòstras de PPA, doas vias amb una abondància significativament mai nauta èran ligadas al metabolisme de sucre aminosucre/nucleotid (ko:K21279) e a de vias multiplas de metabolisme lipidic (ko:K00647, ko:K03801; Taula suplementària 3). Los gèns associats amb ko:K21279 son coneguts per èsser associats al genre Bacteroides, un dels genres amb un nombre significativament mai naut d'espècias dins los mòstras PPA. Aquel enzim pòt escapar a la responsa immunitària en exprimissent de polisacaridas capsulars (Wang et al., 2008). Aquò pòt explicar l'aument de Bacteroidetes observat dins de mirgas expausadas a PPA. Aquò complèta l'aumentacion de la sintèsi d'acids grasses observada dins lo microbiòma PPA. Las bacterias utilizan la via FASIIko:K00647 (fabB) per produire d'acids grasses, que pòdon influenciar las vias metabolicas de l'òste (Yao e Rock, 2015; Johnson et al., 2020), e los cambiaments dins lo metabolisme lipidic pòdon jogar un ròtle dins lo neurodesvolopament (Yu et al., 2020). Un autre camin mostrant una abondància aumentada dins de mòstras de PPA èra la biosintèsi d'ormonas esteroïdas (ko:K12343). I a de pròvas creissentas que i a una relacion invèrsa entre la capacitat de la microbiòta intestinala d'influenciar los nivèls d'ormonas e d'èsser influenciat per las ormonas, de tal biais que los nivèls d'esteroïdes elevats pòdon aver de consequéncias sus la santat en aval (Tetel et al., 2018).
Aqueste estudi es pas sens limitacions e consideracions. Una distincion importanta es que faguèrem pas d'avaloracions fisiologicas dels animals. Es doncas pas possible de conclure dirèctament se los cambiaments dins lo microbiòma son associats a quina malautiá que siá. Una autra consideracion es que las mirgas d'aqueste estudi foguèron noiridas amb la meteissa dièta que lors maires. D'estudis futurs pòdon determinar se lo passatge d'una dièta rica en PPA a una dièta sens PPA melhora sos efièches sul microbiòma. Una limitacion de nòstre estudi, coma fòrça autres, es la talha limitada de la mòstra. E mai se de conclusions validas pòdon èsser tiradas, una talha de mòstra mai granda provesiriá una poténcia estatistica mai granda al moment d'analisar los resultats. Sèm tanben prudents a prepaus de tirar de conclusions sus una associacion entre los cambiaments dins lo microbiòma intestinal e quina malautiá que siá (Yap et al., 2021). De factors de confusion, inclusent l'edat, lo genre e la dièta, pòdon influenciar de manièra significativa la composicion dels microorganismes. Aquestes factors pòdon explicar las incoeréncias observadas dins la literatura al subjècte de l'associacion del microbiòma intestinal amb de malautiás complèxas (Johnson et al., 2019; Lagod e Naser, 2023). Per exemple, los membres del genre Bacteroidetes son estats mostrats èsser siá aumentats siá diminuits dins los animals e los umans amb ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). De manièra similara, d'estudis de composicion intestinala dins de pacients amb de malautiás inflamatòrias intestinalas an trobat a l'encòp d'aumentacions e de diminucions dins los meteisses taxons (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Per limitar l'impacte del biais de genre, ensagèrem d'assegurar una representacion egala dels sèxes per que las diferéncias foguèsson mai probablament menadas per la dièta. Un desfís de l'anotacion foncionala es la supression de sequéncias de gèns redondants. Nòstre metòde d'agropament de gèns demanda 95% d'identitat de sequéncia e 85% de similitud de longor, e tanben 90% de cobertura d'alinhament per eliminar lo fals agropament. Pasmens, dins qualques cases, observèrem de COG amb las meteissas anotacions (per exemple, MUT) (Fig. 6). D'estudis suplementaris son necessaris per determinar se aqueles ortològs son distinctes, associats a de genres especifics, o s'aquò es una limitacion de l'apròchi de l'agropament dels gèns. Una autra limitacion de l'anotacion foncionala es la classificacion potenciala erronèa; lo gèn bacterian mmdA es un enzim conegut implicat dins la sintèsi de propionat, mas KEGG l'associa pas a la via metabolica del propionat. En contraste, los ortològs scpB e mmcD son ligats. Lo grand nombre de gèns sens knockouts designats pòt resultar en una incapacitat d'identificar de gèns ligats a PPA al moment d'avalorar l'abondància de gèns. Los estudis futurs beneficiaràn de l'analisi del metatranscriptòma, que pòt provesir una compreneson mai prigonda de las caracteristicas foncionalas del microbiòta intestinal e ligar l'expression genica a d'efièches potencials en aval. Per d'estudis qu'implican de desòrdres neurodesvolopament especifics o de malautiás inflamatòrias intestinalas, d'avaloracions fisiologicas e comportamentalas dels animals son necessàrias per ligar los cambiaments dins la composicion del microbiòma a aqueles desòrdres. D'estudis suplementaris transplantant lo microbiòma intestinal dins de mirgas sens germes serián tanben utils per determinar se lo microbiòma es un motor o una caracteristica de la malautiá.
En resumit, demostrèrem que lo PPA alimentari agís coma un factor per alterar la composicion del microbiota intestinal. Lo PPA es un conservant aprovat per la FDA que se tròba largament dins divèrses aliments que, a l'exposicion a long tèrme, pòt menar a una perturbacion de la flòra intestinala normala. Trobèrem de cambiaments dins l'abondància de divèrsas bacterias, çò que suggerís que la PPA pòt influenciar la composicion del microbiòta intestinal. Los cambiaments dins la microbiòta pòdon menar a de cambiaments dins los nivèls de cèrtas vias metabolicas, çò que pòt menar a de cambiaments fisiologics que son pertinents per la santat de l'òste. D'estudis suplementaris son necessaris per determinar se los efièches de la PPA dietetica sus la composicion microbiana pòdon menar a la disbiòsi o a d'autras malautiás. Aqueste estudi pausa las basas per d'estudis futurs sus cossí los efièches de la PPA sus la composicion intestinala pòdon impactar la santat umana.
Los ensembles de donadas presentats dins aqueste estudi son disponibles dins de depauses en linha. Lo nom del depaus e lo numèro d'accès son: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Aqueste estudi animal foguèt aprovat pel Comitat Institucional de Suènh e Utilizacion dels Animals de l'Universitat de Florida Centrala (UCF-IACUC) (Numèro de Permés d'Utilizacion Animal: PROTO202000002). Aqueste estudi se confòrma a las leis, las regulacions e las exigéncias institucionalas localas.
NG: Conceptualizacion, Curacion de donadas, Analisi formala, Recèrca, Metodologia, Logicial, Visualizacion, Escritura (borrolhon original), Escritura (revision e edicion). LA: Conceptualizacion, Curacion de donadas, Metodologia, Ressorsas, Escritura (revision e edicion). SH: Analisi formala, Logicial, Escritura (revision e edicion). SA: Recèrca, Escritura (revision e edicion). Jutge en cap: Enquèsta, Redaccion (revision e edicion). SN: Conceptualizacion, Administracion de projècte, Ressorsas, Supervision, Redaccion (revision e edicion). TA: Conceptualizacion, Administracion de projècte, Supervision, Escritura (revision e edicion).
Los autors declarèron que recebèron pas cap de sosten financièr per la recèrca, l'autor e/o la publicacion d'aqueste article.
Los autors declaran que la recerca foguèt menada en l'abséncia de relacions comercialas o financièras que poirián èsser interpretadas coma un conflicte d'interèsses potencial. pas aplicable.
Totas las opinions exprimidas dins aqueste article son unicament aquelas dels autors e reflèchan pas necessàriament las opinions de lors institucions, editors, redactors o revisors. Totes los produches avalorats dins aqueste article, o totas las revendicacions fachas per lors fabricants, son pas garantits o avalorat per l'editor.
Lo material suplementari per aqueste article se pòt trobar en linha: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). L'acid propionic indusís la gliòsi e la neuroinflamacion en regulant la via PTEN/AKT dins los desòrdres de l'espèctre autista. Rapòrts scientifics 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Analisi estatistica de donadas de composicion. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Rapòrt Firmicutes/Bacteroidetes coma factor de risc pel càncer de mama. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analisi d'expression diferenciala de donadas de compte de sequéncias. Nat Prev. 1-1, 1-10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). La microbiòta fecala e lo metabolòma dins los enfants amb autisme e un desòrdre del desvolopament pervasiu pas autrament especificat. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Caracteristicas neurometabolicas bacterianas de la microbiòta intestinala dins los enfants pichons amb de desòrdres de l'espèctre autista. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Lo microbiòma coma organ uman. Microbiologia Clinica e Infeccion 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). De novèlas coneissenças sus la fisiologia de las bacterias productoras d'acid propionic: Anaerotignum propionicum e Anaerotignum neopropionicum (ancianament Clostridium propionicum e Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Nutricion mairala e desvolopament fetal. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., e Hochberg, J. (1995). Contrarotlar lo taus de falses positius: Una apròcha practica e eficienta de tèsts multiples. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Ora de publicacion: 18 d'abril de 2025