Lo triatge de proteïnas dins la via secretòria es essencial per manténer la compartimentacion cellulara e l'omeostasi. En mai del triatge mediat per la clòsca, lo ròtle dels lipids dins lo triatge de la cinesina dins lo procès de transpòrt secretori es una question de basa de longa data qu'es pas encara estada responduda. Aquí, realizam d'imatgerias multicoloras simultanèas en temps real de nauta resolucion 3D per provar in vivo que las proteïnas immobilizadas per glicosilfosfatidilinositol recentament sintetizadas amb de fraccions lipidicas de ceramida fòrça longas son agropadas e classadas dins d'endoplasmas especializats Net exit site, qu'es diferent d'aquel utilizat per las proteïnas transmembrana. De mai, mostram que la longor de cadena de la ceramida dins la membrana del reticul endoplasmatic es critica per aquela selectivitat de classament. Nòstre estudi provesís la primièra pròva dirècta in vivo per classificar las cargas de proteïnas en foncion de la longor de la cadena lipida dins de sites d'exportacion selectius dins la via secretòria.
Dins las cellulas eucariotas, las proteïnas sintetizadas dins lo reticul endoplasmatic (ER) son alara triadas pendent lo transpòrt a travèrs la via secretòria per la liurason a lor destinacion cellulara apropriada (1). En mai del triatge mediat per la cobèrta, foguèt longtemps especulat que certans lipids pòdon tanben servir de punts de sortida selectius en los agropant dins de domenis de membrana especifics que las proteïnas especificas (2-5). Pasmens, i a encara una manca d'evidéncia in vivo dirècta per provar aquel possible mecanisme basat sus de lipids. Per resòlvre aquel problèma de basa, estudièrem dins la levadura cossí las proteïnas ancoradas al glicosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) son exportadas diferencialament dempuèi l'ER. Los GPI-AP son una varietat de proteïnas de superfícia cellulara connectadas a de lipids ( 6, 7). GPI-AP es una proteïna secretada fixada als fuèlhs exteriors de la membrana plasmatica a travèrs la partida glicolipida (ancra GPI). Acceptan d'ancras GPI coma de modificacions post-translacionalas conservatriças dins lo lumen ER (8). Après l'acoblament, GPI-AP passa per l'aparelh de Golgi (5, 9) de l'ER a la membrana plasmatica. La preséncia d'ancras GPI fa que GPI-AP siá transportat separadament de las proteïnas secretadas transmembrana (inclusent d'autras proteïnas de la membrana plasmatica) lo long de la via secretòria (5, 9, 10). Dins las cellulas de levat, los GPI-AP son separats d'autras proteïnas secretadas dins lo reticul endoplasmatic, e puèi embalats dins de vesiculas unicas enrotladas pel complèxe de proteïna de cobèrta II (COPII) (6, 7). Los determinants d'aqueste procès de classificacion dins lo procès d'exportacion ER son pas clars, mas s'especula qu'aqueste mecanisme pòt demandar de lipids, mai que mai lo remodelatge estructural de la porcion lipida de l'ancra GPI (5, 8). Dins la levadura, lo remodelatge lipidic GPI comença immediatament après que lo GPI s'ataca, e dins fòrça cases, fa que la ceramida se liga a l'acid gras saturat de cadena longa de 26 carbònis (C26:0) (11, 12). La ceramida C26 es la ceramida principala produsida per las cellulas de levat fins ara. Es sintetizada dins l'ER e la màger part es exportada a l'aparelh de Golgi a travèrs de vesiculas COPII (13). L'exportacion ER de GPI-AP demanda especificament una sintèsi de ceramida en cors (14, 15), e a son torn, la conversion de ceramida en ceramida de fosfat inositol (IPC) dins l'aparelh de Golgi depend de la sintèsi d'ancra GPI (16). D'estudis biofisics amb de membranas artificialas an mostrat que las ceramidas de cadena acil fòrça longa pòdon coalescer per formar de domenis ordenats amb de proprietats fisicas unicas (17, 18). Aquestas donadas menan a l'ipotèsi que la ceramida C26 e lo GPI-AP amb la ceramida C26 utilizan lors proprietats fisicas per s'amassar dins de regions ordenadas o de regions dins l'environament lipidic de la membrana ER relativament desordenada. Es subretot compausat de glicerolipids corts e insaturats (C16:1 e C18:1) (19, 20). Aquelas regions seràn selectivament centradas sus de sites de sortida ER especifics (ERES), ont la ceramida e lo GPI-AP basat sus la ceramida pòdon èsser cotransportats al Golgi dins la meteissa vesicula COPII dedicada (5).
Dins aqueste estudi, avèm dirèctament testat aquel mecanisme basat sus de lipids en utilizant la microscopia d'imatgeria confocala en temps real de superresolucion (SCLIM), qu'es una tecnica de microscopia de punta que pòt observar a l'encòp de proteïnas marcadas de manièra fluorescenta Las imatges tricoloras e tridimensionalas (3D) an una resolucion extrèmament nauta e una velocitat dins las cellulas vivas (22, 2).
Aplicam d'en primièr la tecnologia SCLIM per definir mai cossí lo GPI-AP normal amb lo grop de ceramida C26 foguèt cribrat de proteïnas secretadas transmembrana après aver quitat l'ER dins S. cerevisiae. Per verificar la classificacion de l'ER, utilizèrem un sistèma genetic que pòt visualizar dirèctament la carga recentament sintetizada dintrant dins l'ERES in vivo (7, 23). Coma carga, causiguèrem GPI-AP Gas1 a basa de ceramida C26 marcat amb de proteïna fluorescenta verda (GFP) e de proteïna secretada transmembrana Mid2 marcada amb de proteïna fluorescenta prèp infraroja (iRFP), que ciblan totas doas la membrana plasmatica (24–26). Dins lo mutant sensible a la temperatura sec31-1, aqueles dos cargues son exprimits jos un promotor induch per la galactosa e un marcador ERES constitutiu. A la temperatura extrèma (37°C), perque la mutacion sec31-1 afecta la foncion del compausant de la capa COPII Sec31 per inhibir la germinacion de COPII e l'exportacion d'ER, la carga recentament sintetizada s'acumula a l'ER (23). Après refregiment a una temperatura bassa (24°C), las cellulas mutantas sec31-1 se recuperèron de l'airal secretòri, e la novèla carga sintetica acumulada comencèt d'èsser exportada de l'ER. La visualizacion CLIM mostrèt que la màger part dels Gas1-GFP e Mid2-iRFP recentament sintetizats s'acumulavan encara dins l'ER de las cellulas mutantas sec31-1 après incubacion a 37°C e puèi liberats a 24°C pendent 5 minutas (Figura 1). Coma Mid2-iRFP es distribuit sus tota la membrana ER, e Gas1-GFP es concentrat e amassat dins l'airal de la membrana ER discontinua, lor distribucion es completament diferenta (Figura 1, A a C e Filme S1). De mai, coma mostrat dins la Figura 1D, lo cluster Gas1-GFP a pas Mid2-iRFP. Aquestes resultats indican que las proteïnas GPI-AP e transmembrana foguèron separadas dins diferentas regions de membrana ER lèu. Lo cluster Gas1-GFP es adjacent a un ERES especific marcat amb la proteïna de coat COPII de mCherry Sec13 (Figura 1, E e F, e filme S1) (23).
las cellulas sec31-1 exprimisson de secrecions induchas per la galactosa, una longa cadena acil (C26) de ceramida GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verd) e la proteïna transmembrana Mid2-iRFP (TMP, blau) e aquel ERES constructiu marcat Sec13-mCherry (E) foguèt magnificat a 30 ° C minutas, desplaçat a 24°C, e imatgerat per SCLIM 5 minutas mai tard. (A a C) mòstra una imatge 2D fusionada o sola representativa d'un plan (A), una imatge de projeccion 2D de 10 seccions z (B) o una imatge d'emisfèri cellular 3D de marcaires de carga e ERES (C). Barra d'escala 1μm (A e B). L'unitat d'escala es de 0,551 μm (C). Gas1-GFP foguèt detectat dins de regions o d'amassas ER discrètas, del temps que Mid2-iRFP foguèt detectat e distribuit dins tota la membrana ER (C). (D) Lo grafic mòstra l'intensitat de fluorescéncia relativa de Gas1-GFP e Mid2-iRFP dins lo cluster Gas1-GFP lo long de la linha de flècha blanca (esquèrra). AU, unitat arbitrària. (E e F) representan l'imatge 3D que combina la merça e la marca ERES. De clusters Gas1-GFP foguèron detectats còsta l'ERES especific. L'unitat d'escala es de 0,551 μm. (F) La flècha solida blanca marca lo cluster Gas1-GFP associat a ERES. Los panèls del mièg e de drecha mòstran l'imatge 3D agrandida fusionada e una vista rotada del cluster Gas1-GFP seleccionat.
La relacion espaciala estrecha entre lo cluster Gas1-GFP e un ERES especific indica que Gas1-GFP pòt dintrar en ERES selectiu, çò qu'es diferent de la selectivitat utilizada per Mid2-iRFP per sortir de l'ER. Per abordar aquela possibilitat, quantifiquèrem lo rapòrt ERES per sonque un o dos bens (Figura 2, A a C). Trobèrem que la màger part dels ERES (70%) contenon pas qu'un tipe de carga. L'imatge inferior de la Figura 2C mòstra dos exemples tipics d'ERES amb sonque Gas1-GFP (Figura 1) o sonque Mid2-iRFP (Figura 2). En contraste, aperaquí 20% de l'ERES conten doas cargas que se superpausan dins la meteissa zòna. Se trobèt que qualques ERES (10%) contenián dos tipes de carga, mas èran isolats dins d'airals clarament diferents. Doncas, aquela analisi estatistica mòstra qu'après l'exportacion de l'ER, GPI-AP Gas1-GFP e la carga transmembrana Mid2-iRFP son devesits en diferents ERES (Figura 2D). Aquesta eficiéncia de tria es fòrça coerenta amb l'analisi bioquimica precedenta (6) e la determinacion morfologica (7). Podèm tanben observar lo comportament de la carga en quarantena dintrant dins l'ERES (Figura 2E e Filme S2). La figura 2E mòstra que sonque una pichona porcion de Gas1-GFP (panèl 3) o Mid2-iRFP (panèl 4) dintra dins l'ERES d'un costat e es confinada dins una zòna discrèta. Lo panèl 5 de la Figura 2E mòstra que Gas1-GFP e Mid2-iRFP se tròban de còps dins lo meteis ERES, mas dintran de costats diferents e son concentrats dins de regions separadas que pòdon representar de vesiculas COPII diferentas. Confirmèrem tanben que la separacion e la classificacion observadas de GPI-AP Gas1 basat sus la ceramida C26 coma ERES selectiu es especifica perque un autre cargament de secrecion transmembrana, la proteïna de membrana plasmatica etiquetada per GFP Axl2 (27 ), mòstra un comportament similar a Mid2-iRFP. (Imatge S1 e Filme S3). L'Axl2-GFP recentament sintetizat es distribuit a travèrs la membrana ER coma Mid2-iRFP (Figura S1, A e B), e es co-localizat amb Mid2-iRFP dins la màger part dels ERES (Figura S1, B a D). Los panèls 1 e 2 de la Figura 1. S1C mòstra dos exemples tipics d'ERES ont doas cargas transmembrana se superpausan. Dins aqueles cases, los dos bens dintran en ERES amassa (Figura S1E, Panèl 3 e Filme S3).
Las cellulas sec31-1 qu'exprimisson de secrecions induciblas de galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verd) e Mid2-iRFP (TMP, blau) e l'etiquetatge ERES constitutiu Sec13-mCherry (ERES, magenta) foguèron plaçadas a 37 Après l'incubacion pendent 30 minutas a 24 °C, se desplaçar cap a la liberacion de l'imatge, e blocar l'imatge amb SCLIM après 20 minutas. (A a C) Imatges de projeccion 2D representatius (A; barra d'escala, 1μm) o d'imatges d'emisfèri cellular 3D (B e C; unitat d'escala, 0,456μm) de la carga e 10 z-seccions marcadas per ERES. Lo panèl inferior dins (B) e lo panèl dins (C) afichan d'imatges tractats per afichar sonque los bens presents dins ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) e Mid2-iRFP (blau clar)]. (C) Flècha dobèrta: ERES pòrta pas qu'una pèça de carga (1 a 4). Sageta grisa: ERES conten de carga segregada (5). Sageta solida blanca: ERES que conten de carga co-localizada. Çai-jos: L'ERES unic seleccionat conten pas que Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Barra d'escala, 100 nm. (D) Quantificacion de la fotomicrografia descricha dins (C). Lo percentatge mejan d'ERES que conten pas qu'una carga (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), carga segregada e carga superposada. Dins tres experiéncias independentas, n=432 dins 54 cellulas. Barra d'error = SD. T tèst non acoblat de doas coas. *** P = 0,0002. (E) Imatge 3D d'ERES seleccionat de carga en quarantena marcada amb (C). Gas1-GFP (verd) (3) o Mid2-iRFP (blau) (4) dintra dins ERES (magenta) d'un costat e es restrench a una pichona zòna dins ERES. De còps, los dos tipes de carga dintran dins lo meteis ERES (5) del meteis costat e son confinats a una zòna isolada dins l'ERES. Barra d'escala, 100 nm.
En seguida, testèrem una ipotèsi que la ceramida de cadena acil longa (C26) presenta dins la membrana ER mena l'agropament e lo triatge especifics de Gas1 dins ERES selectius. A aquò, utilizèrem una soca de levat modificada GhLag1, que las doas sintasas de ceramida endogènas Lag1 e Lac1 foguèron remplaçadas per GhLag1 (l'omològ Lag1 del coton), çò que resultèt en una soca de levat amb una soca de ceramida de membrana cellulara mai corta que lo tipe salvatge (Figura 3A) (28). L'analisi d'espectrometria de massa (EM) mostrèt que dins las socas de tipe salvatge, 95% de la ceramida totala es una ceramida de cadena fòrça longa (C26), del temps que dins GhLag1, 85% de la ceramida es fòrça longa (C18 e C16). ), sonque 2% de la ceramida es de ceramida de cadena fòrça longa (C26). E mai se las ceramidas C18 e C16 son las principalas ceramidas detectadas dins la membrana GhLag1 fins ara, l'analisi MS confirmèt tanben que l'ancra GPI de Gas1-GFP exprimida dins la soca GhLag1 conten de ceramida C26, qu'es comparabla als lipids de tipe salvatge. La qualitat es la meteissa (Fig. 3A) (26). Doncas, aquò vòl dire que l'enzim de remodelacion de ceramida Cwh43 es fòrça selectiu per la ceramida C26, coma mostrat dins la Figura 26, incorpòra preferéncialament l'ancra GPI d'una pichona quantitat de ceramida C26 dins la soca GhLag1. S2 (29). Pasmens, la membrana cellulara de GhLag1 conten basicament pas que de ceramida C18-C16, del temps que Gas1-GFP a encara de ceramida C26. Aqueste fach fa d'aquela soca un aisina ideala per resòlvre especificament lo problèma de la longor de la cadena acil de la ceramida de membrana dins l'ER. Lo ròtle ipotetic de la classa e del triatge. Puèi, estudièrem d'en primièr la capacitat de C26 Gas1-GFP de s'acumular en amassas dins GhLag1 amb un allèl mutant sensible a la temperatura de sec31-1 a travèrs la microscopia de fluorescéncia convencionala, ont sonque la cadena longa (C18-C16) existís dins la membrana ER Ceramide (Fig. 3). Observèrem que dins sec31-1, la màger part de Gas1-GFP èra concentrat en clusters, del temps que Gas1-GFP dins sec31-1 GhLag1 amb una membrana ER de ceramida longa (C18-C16) èra subretot pas agropada e distribuida dins la membrana ER entièra. Per èsser precis, perque l'agropament basat sus la ceramida C26 es estrechament ligat a d'ERES especifics (Figura 1), investiguèrem en seguida se aquel procès pòt tanben implicar la foncion del mecanisme de proteïna d'exportacion ER. GPI-AP utiliza un sistèma COPII especial per l'exportacion d'ER, qu'es activament regulat per la remodelacion estructurala de Ted1 de la porcion de glican de l'ancra GPI (30, 31). Lo GPI-glican recombinant es alara reconegut pel complèxe p24 del receptor de carga transmembrana, que recruta a son torn selectivament Lst1, qu'es una isoforma especifica de la sosunitat de ligason de carga COPII màger Sec24, formant una COPII rica en GPI-AP De vesiculas son necessàrias (31-33). Doncas, bastiguèrem un mutant doble que combinèt la supression d'aquelas proteïnas solas (lo compausant p24 complèxe Emp24, l'enzim de remodelacion GPI-glican Ted1 e la sosunitat COPII especifica Lst1) amb la soca mutanta sec31-1, e los estudièrem Es possible de formar Gas1-Luster GFP (Figura 33). Observèrem que dins sec31-1emp24Δ e sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP es subretot desgropat e distribuit dins tota la membrana ER, coma vist prèviament dins sec31-1 GhLag1, del temps que dins sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Like sec31-1-1. Aquestes resultats indican qu'en mai de la preséncia de ceramida C26 dins la membrana ER, l'agropament de Gas1-GFP a tanben besonh de se ligar al complèxe p24, e necessita pas de recrutament especific de Lst1. Puèi, explorèrem la possibilitat que la longor de cadena de la ceramida dins la membrana ER pòsca regular la ligason de Gas1-GFP a p24. Pasmens, trobèrem que la preséncia de ceramida C18-C16 dins la membrana afecta pas los GPI-glicans reconstruches pel complèxe p24 (Figuras S3 e S4, A e B) o la ligason a GPI-AP e l'exportacion de GPI-AP. capacitat. Recrutar lo sostipe COPII Lst1 (Figura S4C). Doncas, l'agropament dependent de la ceramida C26 demanda pas d'interaccions de proteïnas amb diferents mecanismes de proteïnas d'exportacion ER, mas pren en carga un mecanisme de classament alternatiu menat per la longor lipida. Puèi, analisèrem se la longor de la cadena acil de ceramida dins la membrana ER es importanta per la classificacion eficaça de Gas1-GFP coma ERES selectiu. Coma Gas1 dins la soca GhLag1 amb ceramida de cadena corta sortís de l'ER e dintra dins la membrana plasmatica (Figura S5), cresèm que se lo triatge es menat per la longor de la cadena acil de ceramida, lo Gas1 dins la soca GhLag1 pòt èsser redirigit e crosat. Bens ERES amb la meteissa membrana.
(A) La membrana cellulara de GhLag1 conten subretot de ceramidas C18-C16 mai cortas, del temps que l'ancra GPI de Gas1-GFP a encara lo meteis IPC C26 que las cellulas de tipe salvatge. Dessús: analisi de la longor de la cadena acil de ceramida dins la membrana cellulara de socas de tipe salvatge (Wt) e GhLag1p per espectrometria de massa (MS). Las donadas representan lo percentatge de ceramida totala. La mejana de tres experiéncias independentas. Barra d'error = SD. T tèst non acoblat de doas coas. **** P ＜0,0001. Panèl inferior: analisi MS de la longor de la cadena acil de l'IPC present dins l'ancra GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) exprimida dins las socas de tipe salvatge e GhLag1p. Las donadas representan lo percentatge de senhal IPC total. Mejana de cinc experiéncias independentas. Barra d'error = SD. T test non acoblat de doas coas. ns, pas important. P = 0,9134. (B) De micrografas de fluorescéncia de cellulas sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ e sec31-1lst1Δ qu'exprimisson Gas1-GFP induchas per la galactosa foguèron incubadas a 37°C pendent 30 minutas e de fluorescéncias passadas per una performància en bas microscopia après 24°C. Flècha blanca: amassa ER Gas1-GFP. Flècha dobèrta: Gas1-GFP non agropat es distribuit sus tota la membrana ER, mostrant la coloracion de l'anèl nuclear caracteristic ER. Barra d'escala, 5μm. (C) Quantificacion de la fotomicrografia descricha dins (B). Lo percentatge mejan de cellulas amb estructura Gas1-GFP ponctuada. Dins tres experiéncias independentas, n≥300 cellulas. Barra d'error = SD. T tèst non acoblat de doas coas. **** P ＜0,0001.
Per resòlvre dirèctament aquel problèma, faguèrem una visualizacion SCLIM de Gas1-GFP e Mid2-iRFP dins GhLag1 amb l'allèl mutant sensible a la temperatura sec31-1 (Figura 4 e Filme S4). Après que l'ER foguèt retengut a 37°C e posteriorament liberat a 24°C, la màger part del Gas1-GFP recentament sintetizat foguèt pas agropat e distribuit dins tota la membrana ER, coma observat per de microscòpis convencionals (Figura 4, A e B ). De mai, un grand percentatge d'ERES (67%) inclutz dos tipes de carga co-localizats en el (Figura 4D). Los panèls 1 e 2 de la Figura 4C mòstran dos exemples tipics d'ERES amb Gas1-GFP e Mid2-GFP que se superpausan. De mai, los dos bens foguèron recrutats dins lo meteis ERES (Figura 4E, panèl 3 e filme S4). Doncas, nòstres resultats indican que la longor de la cadena acil de ceramida dins la membrana ER es un determinant important de l'agregacion e de la classificacion de las proteïnas ER.
De cellulas Sec31-1 GhLag1 qu'exprimisson de secrecions induchas per la galactosa, Gas1-GFP (GPI-AP, verd) e Mid2-iRFP (TMP, blau) e Sec13-mCherry constitutius marcats per ERES (ERES, magenta) Incuban a 37°C. Contunhar pendent 30 minutas, baissar a 24°C per liberar de secrecions, e imatge amb SCLIM après 20 minutas. (A a C) Imatges de projeccion 2D representatius (A; barra d'escala, 1μm) o d'imatges d'emisfèri cellular 3D (B e C; unitat d'escala, 0,45μm) de las 10 seccions z marcadas per carga e ERES. Lo panèl inferior dins (B) e lo panèl dins (C) afichan d'imatges tractats per afichar sonque los bens presents dins ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) e Mid2-iRFP (blau clar)]. (C) Sageta emplenada blanca: ERES, superposicion de merças. Flècha dobèrta : ERES conten pas qu'un element. Panèl inferior: L'ERES seleccionat a de bens superpausats (1 e 2) marcats dins (C). Barra d'escala, 100 nm. (D) Quantificacion de la fotomicrografia descricha dins (C). Dins las unitats GhLag1 sec31-1 e sec31-1, sonque una carga (Gas1-GFP o Mid2-iRFP) es inclusa, e lo percentatge mejan d'ERES per la carga isolada e la carga superposada. Dins tres experiéncias independentas, n = 432 dins 54 cellulas (sec31-1) e n = 430 dins 47 cellulas (sec31-1 GhLag1). Barra d'error = SD. T tèst non acoblat de doas coas. *** P = 0,0002 (sec31-1) e ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imatge 3D d'ERES seleccionat amb carga superposada (3) marcada dins (C). Gas1-GFP (verd) e Mid2-iRFP (blau) s'apròchan d'ERES (magenta) del meteis costat e demòran dins la meteissa zòna restrencha ERES. Barra d'escala, 100 nm.
Aqueste estudi provesís d'evidéncias in vivo dirèctas que las cargas de proteïnas basadas sus de lipids son classadas en sites d'exportacion selectius dins la via secretòria, e revela l'importància de la longor de la cadena acil per la selectivitat de classament. En utilizant una tecnica de microscopia poderosa e de punta nomenada SCLIM, demostrèrem lo Gas1-GFP recentament sintetizat (un GPI-AP de membrana plasmatica màger amb una porcion lipida de ceramida de cadena acil (C26) fòrça longa) dins la levadura) Las regions agropadas dins d'ERs discrets son associadas amb d'ERRES especificas, del temps que de proteïnas transmembranas son secretadas a travèrs de la membrana ERRES (Figura 1). De mai, aqueles dos tipes de bens dintran selectivament dins diferents ERES (Figura 2). La longor de la cadena acil de la ceramida cellulara dins la membrana es redusida de C26 a C18-C16, lo cluster Gas1-GFP es perturbat dins la region discrèta ER, e Gas1-GFP es redirigit per sortir de l'ER amb la proteïna transmembrana a travèrs lo meteis ERES (Figura 3 e Figura 3). 4).
E mai se GPI-AP utiliza un mecanisme de proteïnas especializat per sortir de l'ER, trobèrem que la separacion dependenta de la ceramida C26 s'apièja pas sus d'interaccions de proteïnas diferencialas que pòdon menar a l'especializacion ERES (Figuras S4 e S5). En plaça, nòstras descobèrtas sostenon un mecanisme de classificacion alternatiu menat per l'agropament de proteïnas basadas sus de lipids e l'exclusion seguenta d'autres cargaments. Nòstras observacions indican que la region o cluster Gas1-GFP associat a un ERES especific manca de la proteïna secretada transmembrana Mid2-iRFP, çò qu'indica que lo cluster GPI-AP dependent de la ceramida C26 facilitarà lor dintrada dins l'ERES pertinent, e al meteis temps, exclurà la transmembrana Las secrecions dintran dins aquel ERES particular (Figuras 2 e ERES). En contraste, la preséncia de ceramidas C18-C16 dins la membrana ER fa pas que GPI-AP forme de regions o d'amassas, per çò qu'excluson pas o remplaçan pas de proteïnas secretadas transmembrana dins lo meteis ERES (Figuras 3 e 4). . Doncas, prepausam que la ceramida C26 mena la separacion e la classificacion en facilitant l'agropament de proteïnas ligadas a d'ERES especifics.
Cossí obténer aquel agropament dependent de la ceramida C26 dins una zòna ER especifica? La tendéncia de la ceramida de membrana a se separar lateralament pòt far que la ceramida GPI-AP e C26 formen de lipids pichons e instantanèament ordenats dins l'environament lipidic mai irregular de la membrana ER que conten de glicerolipids mai corts e insaturats. Clusters de qualitat (17, 18). Aquestes pichons amassats temporaris pòdon èsser mai fusionats en amassas mai grands e mai estables après se ligar al complèxe p24 (34). Coerent amb aquò, mostrèrem que C26 Gas1-GFP a besonh d'interagir amb lo complèxe p24 per formar d'amassas visibles mai grandas (Figura 3). Lo complèxe p24 es un oligòmer eterozigòt compausat de quatre proteïnas transmembranas p24 diferentas dins la levadura (35), que provesís una ligason multivalenta, que pòt menar a la reticulacion de pichons amassas GPI-AP, en generant aital un amassa estable mai grand (34). L'interaccion entre los ectodominis de proteïnas de GPI-APs pòt tanben contribuir a lor agregacion, coma se vei pendent lor transpòrt de Golgi dins de cellulas epitelialas polarizadas de mamifèrs (36). Pasmens, quand la ceramida C18-C16 es presenta dins la membrana ER, quand lo complèxe p24 se liga a Gas1-GFP, de grands amassas separadas seràn pas formadas. Lo mecanisme sosjacent pòt dependre de las proprietats fisicas e quimicas especificas de la ceramida de cadena acil longa. Los estudis biofisics de las membranas artificialas mòstran que malgrat que las ceramidas de cadena acil longa (C24) e cortas (C18-C16) pòdon causar una separacion de fasa, sonque las ceramidas de cadena acil longa (C24) pòdon promòure una corbadura nauta e una flexion del filme per remodelar lo filme. A travèrs de referéncia mutuala (17, 37, 38). S'es mostrat que l'èlica transmembrana de TMED2, l'omològ uman d'Emp24, interagís selectivament amb l'esfingomielina basada sus la ceramida C18 dins los lòbuls citoplasmatics (39). En utilizant de simulacions de dinamica moleculara (MD), trobèrem que las ceramidas C18 e C26 s'acumulan a l'entorn dels lòbuls citoplasmics de l'èlica transmembrana Emp24, e an de preferéncias similaras (Figura S6). Es de notar qu'aquò indica que l'èlica transmembrana d'Emp24 pòt menar a una distribucion asimetrica dels lipids dins la membrana. Aquò's un resultat recent basat sus de cellulas de mamifèrs. De simulacions MD similaras mòstran tanben la preséncia de lipids etèrs (40) . Doncas, especulam que la ceramida C26 dins los dos lòbuls d'ER26 es localament enriquida. Quand GPI-AP dins los lòbuls luminals se liga dirèctament a p24 multivalent e l'acumulacion de ceramida C26 a l'entorn de p24 dins los lòbuls citoplasmics, pòt promòure l'agregacion de proteïnas e la corbadura de la membrana acompanhantas son generadas a travèrs los dets (41), causant que GPI-AP se separa en regions discrètas adjacentas a de regions d'ERES, que favorizèron tanben las nauta corbadura la membrana ER (42). Los rapòrts precedents sostenguèron lo mecanisme prepausat (43, 44). La ligason multivalenta d'oligolectinas, de patogèns o d'anticòrs als glicosfingolipids basats sus de ceramidas (GSL) sus la membrana plasmatica desencadena una granda agregacion de GSL, melhora la separacion de fasa e provoca la deformacion e l'internalizacion de la membrana (44). Iwabuchi etc. (43) Se trobèt qu'en preséncia de cadenas acilas longas (C24) mas pas cortas (C16), lo ligand multivalent ligat a la lactosilceramida GSL indusiguèt la formacion de grands clusters e l'invaginacion de la membrana, e la transduccion de senhal mediada per Lyn del citoplasma suls fuèlhs es interitat per de cadenas neutrofilas en cobles de neutrofils.
Dins las cellulas epitelialas polarizadas de mamifèrs, la concentracion de la ret anti-Golgi (TGN) al nivèl de la membrana plasmatica apicala contraròtla la separacion e lo triatge de GPI-AP (10, 45). Aquesta agregacion es menada per l'oligomerizacion GPI-AP (36), mas pòt tanben dependre de la longor de la cadena de ceramida que trobam dins la levadura. E mai se lo GPI-AP dels mamifèrs a ​​una ancra basada sus de lipids d'etèr, e son estructura quimica es fòrça diferenta de la ceramida de cadena acil fòrça longa, un estudi recent trobèt que los dos lipids an de proprietats e foncions fisicas e quimicas evolutivament similaras (40). Doncas, la partida lipida etèr dins las cellulas de mamifèrs pòt èsser similara a la ceramida C26 dins la levat, e son ròtle es de s'associar amb la ceramida de cadena longa dins la membrana per promòure l'agregacion e lo triatge GPI-AP. E mai s'aquela possibilitat deu encara èsser testada dirèctament, de descobèrtas precedentas sostenon que lo transpòrt de la ceramida de cadena acil longa al còrs de Golgi es pas realizat per de proteïnas de transferiment citoplasmatica, mas depend de la sintèsi d'ancras GPI coma la levadura. Doncas, lo mecanisme conservator evolutiu sembla èsser capable de cotransportar selectivament de ceramida de cadena acil fòrça longa e GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) dins la meteissa vesicula de transpòrt.
Dins los sistèmas de cellulas epitelialas polarizadas de levat e de mamifèrs, l'agregacion e la separacion GPI-AP d'autras proteïnas de la membrana plasmatica se produson totes abans d'aténher la superfícia cellulara. Paladino et al. (48) trobèt que sul TGN de ​​las cellulas epitelialas polarizadas de mamifèrs, l'agropament GPI-AP es pas solament necessari per la classificacion selectiva de GPI-APs a la membrana plasmatica apicala, mas tanben regula l'organizacion d'agropament de GPI-APs e son activitat biologica. Superfícia de la cellula. Dins la levat, aquel estudi mostrèt que lo cluster GPI-AP dependent de la ceramida C26 sus l'ER pòt regular l'organizacion del cluster e l'activitat foncionala de GPI-AP sus la membrana plasmatica (24, 49). Coerent amb aquel modèl, las cellulas GhLag1 son allergicas als inhibitors GPI o als medicaments qu'afèctan l'integritat de la paret cellulara (28), e lo besonh de clusters Gas1-GFP foncionals (49) de la ceramida de punta projectada dins l'acoblament de las cellulas de levat indica G     De consequéncias fisiologicas possiblas de las cellulas hLag1. Error GPI-AP. Pasmens, de tèsts suplementaris se l'organizacion foncionala de la superfícia cellulara es estada programada dempuèi l'ER per un metòde de triament basat sus la longor dels lipids serà l'objècte de nòstra recerca futura.
Las socas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas dins aqueste trabalh son listadas dins lo tablèu S1. Las socas MMY1583 e MMY1635 de SCLIM per l'imatgeria de cellulas vivas foguèron bastidas dins lo fons de W303. Aquestas socas qu'exprimisson Sec13-mCherry amb una etiqueta de proteïna fluorescenta foguèron bastidas en utilizant un metòde basat sus una reaccion en cadena de polimerasa (PCR) amb un plasmid pFA6a coma modèl (23). La soca qu'exprimís Mid2-iRFP marcada amb de proteïna fluorescenta jos lo contraròtle del promotor GAL1 foguèt bastida de la manièra seguenta. Amplificacion PCR de la sequéncia iRFP-KanMx a partir del vector pKTiRFP-KAN (don d'E. O'Shea, numèro de plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificant de ressorsa de recerca (RRID): Addgene_64687) E inserit dins lo Ctermin endogène de 22. Après que la sequéncia del genòma Mid2-iRFP foguèt amplificada e clonada dins lo promotor GAL1, foguèt integrada dins lo site Not I-Sac I del plasmid d'integracion pRS306. Lo plasmid pRGS7 resultant foguèt linearizat amb Pst I per s'integrar dins lo locus URA3.
Lo gèn de fusion Gas1-GFP es exprimit jos lo contraròtle del promotor GAL1 dins lo plasmid del centromèr (CEN), qu'es bastit de la manièra seguenta. La sequéncia Gas1-GFP foguèt amplificada per PCR a partir del plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (don de L. Popolo) e clonada dins lo site Xma I–Xho I del plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (don de C) . Molinièr; Numèro de plasmid adgène 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Lo plasmid resultant foguèt nomenat pRGS6. Lo gèn de fusion Axl2-GFP es tanben exprimit jos lo contraròtle del promotor GAL1 del vector LEU2 pBEVY-GL, e sa construccion es la seguenta. La sequéncia Axl2-GFP foguèt amplificada a partir del plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) per PCR, e clonada dins lo site Bam HI-Pst I del vector LEU2 pBEVY-GL. Lo plasmid resultant foguèt nomenat pRGS12. La sequéncia dels oligonucleotids utilizats dins aqueste estudi es listada dins lo tablèu S2.
La soca foguèt complementada amb 0,2% d'adenina e 2% de glucòsa [YP-dextròsa (YPD)], 2% de rafinòsa [YP-rafinòsa] ric en extrach de levat de proteïna p (YP) de mitan (1 % d'extrach de levat e 2% de proteïna ept). (YPR)] o 2% de galactosa [YP-galactosa (YPG)] coma font de carbòni, o dins un mitan minimal sintetic (0,15% de basa d'azòt de levat e 0,5% de sulfat d'amòni) per complementar d'acids aminats e de basas apropriats requerits per la nutricion, E contenent 2% de glucosa glucosa (2% de mitan glucotic) o de mitan minimal galactosa (mitan minimal de galactosa sintetica) coma font de carbòni.
Per l'imatgeria en temps real, de cellulas mutantas sec31-1 sensiblas a la temperatura exprimissent lo construct jos lo promotor GAL1 foguèron cultivadas dins un mitan YPR a 24°C pendent la nuèch fins a la fasa de mièg-log. Après induccion dins YPG a 24°C pendent 1 ora, las cellulas foguèron incubadas dins SG a 37°C pendent 30 minutas, e puèi transferidas a 24°C per se liberar del blòc de secrecion. La concanavalina A foguèt utilizada per fixar las cellulas sus una lamina de veire e imatgeda per SCLIM. SCLIM es una combinason de microscòpi de fluorescéncia invertida Olympus IX-71 e d'objectiu d'òli d'apertura numerica UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), d'escanèr confocal de disc rotatòri de nauta velocitat e de naut rapòrt senhal-bruch (Yokogawa Electric), d'espectromètres personalizats, d'imatges d'intensificacion e d'imatges (Hamamatsu Photonics) pòt provesir un sistèma de lentilha d'agrandiment amb una amplificacion finala de ×266,7 e una camèra de dispositiu acoblada a carga que multiplica los electrons (Hamamatsu Photonics) (21). L'aquisicion d'imatge es realizada per un logicial personalizat (Yokogawa Electric). Per d'imatges 3D, utilizèrem un accionador piezoelectric sus mesura per vibrar l'objectiu verticalament, e reculhèrem las pèças opticas a 100 nm d'espaci dins una pila. L'imatge Z-stack es convertit en donadas de voxels 3D, e la foncion teorica de difusion de punt utilizada pel microscòpi confocal de disc rotatòri es utilizada pel tractament de deconvolucion pel logicial Volocity (PerkinElmer). En utilizant lo logicial Volocity per limitar automaticament l'analisi de co-localizacion, l'ERES inclusent la carga foguèt mesurat. L'analisi d'escanatge de linha foguèt realizada en utilizant lo logicial MetaMorph (Molecular Devices).
Utilizatz lo logicial GraphPad Prism per determinar la significacion estatistica. Pel tèst t de Student a doas coas e lo tèst ordinari d'analisi de variança unidireccionala (ANOVA), las diferéncias entre grops son consideradas coma un impacte significatiu sus P <0,05 (*).
Per la microscopia de fluorescéncia de Gas1-GFP, las cellulas de fasa log foguèron cultivadas pendent la nuèch dins YPD e collectadas per centrifugacion, lavadas dos còps amb de salina tamponada amb fosfat, e incubadas sus glaç pendent almens 15 minutas, e puèi procedidas jos lo microscòpi coma descrich prèviament Verificatz (24). Lo microscòpi Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 òli PH3 CS) equipat d'una lentilha d'objectiu, de filtre L5 (GFP), de camèra Hamamatsu e de logicials Application Suite X (LAS X) foguèt utilizat per l'aquisicion. .
Los mòstras foguèron desnaturalizats amb un tampon de mòstra SDS a 65°C pendent 10 minutas, e puèi separats per electroforèsi en gel de poliacrilamida SDS (PAGE). Per l'analisi d'immunoblotatge, 10 μl de mòstra foguèron cargats per via. Anticòrs primari: Utilizar l'anti-Gas1 policlonal de lapin a una dilucion de 1:3000, un anti-Emp24 policlonal de lapin a una dilucion de 1:500, e un anti-GFP policlonal de lapin (un present de H. Riezman) a una dilucion de 1:3000. L'anticòrs anti-Pgk1 monoclonal de mirga foguèt utilizat a una dilucion de 1:5000 (un present de J. de la Cruz). Anticòrs segondari: l'immunoglobulina G (IgG) anti-lapin de cabra conjugada per la peroxidasa de ravan (HRP) utilizada a una dilucion de 1:3000 (Pierce). L'IgG anti-rat de cabra conjugat a HRP foguèt utilizat a una dilucion de 1:3000 (Pierce). La zòna de responsa immunitària foguèt observada pel metòde de quimiluminescéncia del reactiu SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Coma descrich dins (31), un experiment d'immunoprecipitacion naturala foguèt realizat sus la fraccion ER enriquida. En resumit, lavatz las cellulas de levat amb de tampon TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluorur de fenilsulfonil e mescla d'inibitor de proteasa) a 600 nm ( OD600) a 100 densitat optica dos còps. Foguèt trencat amb de perlas de veire, e puèi los escombres de cellula e las perlas de veire foguèron levats per centrifugacion. Lo subrenadant foguèt alara centrifugat a 17 000 g pendent 15 minutas a 4°C. Lo pellet foguèt resuspendut dins TNE e la saponina digitalis foguèt aponduda a una concentracion finala de 1%. La suspension foguèt incubada pendent 1 ora amb rotacion a 4°C, e puèi los compausants insolubles foguèron levats per centrifugacion a 13 000 g a 4°C pendent 60 minutas. Per l'immunoprecipitacion Gas1-GFP, d'en primièr preincubatz la mòstra amb de granas d'agaròsa vuèjas (ChromoTek) a 4°C pendent 1 ora, e puèi incubatz amb GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C pendent 3 oras. Las perlas immunoprecipitadas foguèron lavadas cinc còps amb TNE contenent 0,2% de digoxigenina, eluida amb un tampon de mòstra SDS, separadas sus SDS-PAGE, e analizadas per immunoblotatge.
Coma descrich dins (31), la determinacion de reticulacion foguèt realizada sus la fraccion ER enriquida. Brevament, la fraccion ER enriquida foguèt incubada amb 0,5 mM de ditiobis (propionat de succinimidil) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). La reaccion de reticulacion foguèt apagada en apondent de glicina (concentracion finala de 50 mM, 5 minutas, 20°C).
Coma descrich prèviament (50), l'analisi MS de ceramida dins de socas de tipe salvatge e GhLag1 foguèt realizada. En resumit, las cellulas foguèron cultivadas a la fasa exponenciala (3 a 4 unitats OD600/ml) dins YPD a 30°C, e 25×107 cellulas foguèron culhidas. Lor metabolisme es apagat amb d'acid tricloroacetic. Utilizar solvent d'extraccion [etanòl, aiga, etèr, piridina e 4,2 N d'idròxid d'amòni (15:15:5:1:0,018 v/v)] e 1,2 nmol de qualitat de ceramida C17 estandard intèrne (860517, lipid polar Avanti). Utilizatz lo reactiu de monometilamina [metanòl, aiga, n-butanòl e solucion de metilamina (4:3:1:5 v/v)] per realizar una idrolisi alcalina leugièra de l'extrach, e puèi utilizatz lo n-butanòl saturat d'aiga per desalenar. Fin finala, l'extrach foguèt resuspendut dins un solvent de mòde positiu [cloroform/metanòl/aiga (2:7:1) + 5 mM d'acetat d'amoni] e injectat dins l'espectromètre de massa. Lo seguiment multireaccion (MRM) foguèt realizat per l'identificacion e la quantificacion de las moleculas d'esfingolipids. L'espectromètre de massa quadrupòl terciari TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) es equipat d'una font d'ions de nanoflux robòtic Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) per l'analisi de lipids. L'energia de collision es optimizada per cada categoria de ceramida. Las donadas MS foguèron obtengudas en mòde positiu. Per cada replicat biologic, lo senhal lipidic es la mediana de tres mesuras independentas.
Coma descrich dins (31), las cellulas (800×107) exprimissent Gas1-GFP foguèron somesas a una immunoprecipitacion naturala. Lo Gas1-GFP purificat foguèt separat per SDS-PAGE e transferit cap a una membrana de fluor de polivinilidèn (PVDF). La proteïna foguèt visualizada en colorant PVDF amb d'amida negra. La benda Gas1-GFP foguèt talhada del PVDF e lavada 5 còps amb de metanòl e un còp amb d'aiga de qualitat cromatografia liquida-MS (LC-MS). En incubant la benda de membrana amb 500μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), tampon e 500μl de mescla de nitrit de sòdi 1 M recentament dissolgut a 37°C pendent 3 oras, la fraccion lipida es liberada de Gas1-GFP e lisada Liberacion d'infosofaïna dins la ceraminaïta e la ceramina (51). Après aquò, la benda de membrana foguèt lavada quatre còps amb d'aiga de qualitat LC-MS, secada a temperatura ambienta, e emmagazinada dins una atmosfèra d'azòt a -80°C fins a l'analisi. Coma contraròtle, una mòstra blanca de membrana PVDF foguèt utilizada per cada experiéncia. Lo lipid extrach de Gas1-GFP foguèt alara analizat per MS coma descrich (50). En resumit, de bendas PVDF contenent de GPI-lipid foguèron resuspendadas dins 75μl de solvent de mòtle negatiu [cloroform/metanòl (1:2) + 5 mM d'acetat d'amoni] e passèron l'ionizacion electrospray (ESI)-MRM/MS Analisi d'espècias esfingolipida (TSQ Vantage). Dins aquel cas, las donadas MS foguèron obtengudas en mòde d'ions negatius.
Coma mencionat abans, la porcion lipida de l'ancra GPI foguèt separada del GPI-AP marcat amb [3H]-inositol (16). Los lipids foguèron separats per cromatografia de jaç prim en utilizant un sistèma de solvent (55:45:10 cloroform-metanòl-0,25% KCl) e visualizats en utilizant FLA-7000 (Fujifilm).
Las cellulas exprimissent Gas1-GFP (600×107) foguèron lavadas dos còps amb de tampon TNE amb de tampon TNE, e trencadas amb de perlas de veire, e puèi centrifugadas per levar los escombres cellulars e las perlas de veire. Lo subrenadant foguèt alara centrifugat a 17 000 g pendent 1 ora a 4°C. Lo pellet foguèt lavat dins TNE e incubat amb 1 U PI-PLC (Invitrogen) dins TNE contenent 0,2% de saponina digitalis pendent 1 ora a 37°C. Après lo tractament enzim, la membrana foguèt levada per centrifugacion a 17 000 g a 4°C pendent 1 ora. Per immunoprecipitar Gas1-GFP, lo subrenatant foguèt incubat amb GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C pendent la nuèch. Lo Gas1-GFP purificat separat per SDS-PAGE foguèt colorat amb de blau brilhant Coomassie. La benda de coloracion Gas1-GFP foguèt talhada del gris a l'entorn de l'aqueducte, e puèi après l'alquilacion amb iodoacetamida e la reduccion amb ditiotreitol, la digestion en gel amb tripsina foguèt realizada. Extraire e secar de peptides triptics e de peptides amb de GPI-glicans. Lo peptid sec foguèt dissolgut dins 20 μl d'aiga. Injectar una porcion (8μl) dins lo LC. Una colomna d'octadecilsilan (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diamètre interior 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, Prefectura d'Aichi, Japon) foguèt utilizada per separar de peptides jos de condicions de gradient especificas. La fasa mobila es lo solvent A (0,08% d'acid formic) e lo solvent B (0,15% d'acid formic dins 80% d'acetonitril). Un sistèma Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) foguèt utilizat per eluir la colomna amb de solvent A dins 55 minutas a un debit de 50 μl min-1 pendent 5 minutas, e puèi la concentracion de solvent B foguèt aumentada a 40%. , Estats Units). L'eluat foguèt introduch de contunh dins la font d'ions ESI, e los peptides triptics e peptides amb GPI-glicans foguèron analizats per LTQ Orbitrap XL (espectromètre de massa trap-orbitrap d'ions linear ibrid; Thermo Fisher Scientific). Dins la configuracion MS, la tension de la font capilara foguèt fixada a 4,5 kV, e la temperatura del capilhar de transferiment foguèt mantenguda a 300°C. La tension capillara e la tension de la lentilha del tub foguèron fixadas a 15 V e 50 V, respectivament. Las donadas MS foguèron obtengudas dins lo mòde d'ions positius (resolucion de 60 000; precision de massa de 10 partidas per milion) dins un interval de massa de 300/m/z rapòrt massa/carga (m/z) 3000. Las donadas MS/MS son obtengudas a travèrs la trapèla d'ions dins l'orbita LTQ [ XL 3, las donadas que dependon primièr las donadas dissociacion inducha per la collision (CID)].
Las simulacions MD foguèron realizadas en utilizant lo logicial GROMACS (52) e lo camp de fòrça MARTINI 2 (53-55). Lo CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) foguèt alara utilizat per bastir una bicapa contenent dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) e Cer C18 o DOPC e Cer C26. La topologia e las coordenadas de Cer C26 son derivadas de DXCE en levant las perlas suplementàrias de la coa de l'esfingosina. Utilizatz lo procès descrich çai-jos per equilibrar lo doble calc e l'executar, puèi utilizatz las darrièras coordenadas del sistèma per bastir un sistèma que conten Emp24. Lo domeni transmembranic de la levat Emp24 (residus 173 a 193) foguèt bastit coma una α-èlica en utilizant l'estructura moleculara de l'aisina MD visuala (VMD) (58). Puèi, après aver levat los lipids superpausats, la proteïna foguèt grossièrament granulada e inserida dins la bicapa en utilizant l'interfàcia grafica CHARMM. Lo sistèma final conten 1202 DOPC e 302 Cer C26 o 1197 DOPC e 295 Cer C18 e Emp24. Ionizatz lo sistèma a una concentracion de 0,150M. Quatre replicas independentas foguèron fachas per doas composicions bicapas.
La bicapa lipida es equilibrada en utilizant lo procès CHARMM GUI, qu'implica de minimizar e puèi d'equilibrar 405 000 estapas, ont las contraintes de posicion son gradualament redusida e eliminadas, e l'estapa de temps es aumentada de 0,005 ps a 0,02 ps. Après l'equilibracion, produtz 6 μs amb un pas de temps de 0,02 ps. Après aver inserit Emp24, utilizatz lo meteis procès GUI CHARMM per minimizar e equilibrar lo sistèma, e puèi executar pendent 8 s en produccion.
Para todos los sistemas, durante el proceso de equilibrio, la presion es controlada por el barostato de Berendsen (59), y durante el proceso de produccion, la presion es controlada por el barostato de Parrinello-Rahman (60). Dins totes los cases, la pression mejana es de 1 bar e un esquèma d'acoblament de pression semiisotròpa es utilizat. Dins lo procès d'equilibri e de produccion, un termostat (61) amb recalibracion de velocitat es utilizat per acoblar la temperatura de las particulas de proteïna, de lipid e de solvent respectivament. Pendent tota l'operacion, la temperatura cibla es de 310K. L'interaccion non-ligam es calculada en generant una lista d'acoblament en utilizant l'esquèma de Verlet amb una tolerància al tampon de 0,005. Lo tèrme de Coulomb es calculat en utilizant lo camp de reaccion e una distància de talh de 1,1 nm. Lo tèrme de Vander Waals utiliza un esquèma de talh amb una distància de talh de 1,1 nm, e l'esquèma de talh de Verlet es utilizat per la deriva potenciala (62).
En utilizant VMD, la longor d'onda de talh entre las perlas de fosfat DOPC o las perlas de ceramida AM1 e la proteïna es de 0,7 nm, e lo nombre de lipids qu'interagisson amb la proteïna es calculat. Segon la formula seguenta, calculatz lo factor d'esgotament-enriquiment (DE) coma dins (63): Factor DE = (la quantitat de lipids totals dins la proteïna 0,7) dins la proteïna 0,7 (la quantitat de Cer dins los lipids totals)
La valor reportada es obtenguda coma mejana, e las barras d'error son quatre còpias independentas de SE. La significacion estatistica del factor DE es calculada per tèst t [(averageDE-factor-1)/SE]. Calculatz la valor P a partir de la distribucion monocola.
L'aisina GROMACS foguèt utilizada per calcular la mapa de densitat laterala 2D del sistèma que conten Emp24 dins los darrièrs 250 ns de la traça. Per obténer la mapa d'enriquiment/esgotament de la ceramida, la mapa de densitat de Cer es dividida per la soma de la mapa de Cer e DOPC, e puèi dividida per la concentracion de Cer dins lo còrs. La meteissa escala de mapa de color es utilizada.
Per de materials suplementaris per aqueste article, mercés de consultar http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
S'agís d'un article d'accès dobèrt distribuit jos las condicions de la licéncia d'atribucion non comerciala Creative Commons , que permet l'usatge, la distribucion e la reproduccion dins quin mèdia que siá, tant que l'usatge final es pas per un profièch comercial e que la premissa es que l'òbra originala es corrècta. Referéncia.
Nòta : Vos demandam pas que de provesir vòstra adreça de corrièl per que la persona que recomandatz a la pagina sàpia que volètz que veja lo corrièl e qu'es pas de spam. Capturarem pas cap d'adreça de corrièl.
Aquesta question es utilizada per testar se sètz un visitor e evitar la somission automatica de spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Sererope (Serhope), Wagazhopez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L'imatgeria 3D en temps real de nauta resolucion revela l'importància de la longor de la cadena de ceramida pel triatge de las proteïnas dins de sites de sortida selectius.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Sererope (Serhope), Wagazhopez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L'imatgeria 3D en temps real de nauta resolucion revela l'importància de la longor de la cadena de ceramida pel triatge de las proteïnas dins de sites de sortida selectius.
©2020 Associacion Americana per l'Avançament de la Sciéncia. totes los dreches reservats. AAAS es un socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.