L'article fa partida del tèma de recerca “Melhorar la resisténcia de las leguminosas als patogèns e als plagas”, veire totes los 5 articles
L'agent causal de la malautiá fongica de la planta necròsi Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary utiliza una estrategia multi-nivèl per infectar diferentas plantas òstes. Aqueste estudi prepausa l'utilizacion de la diamina L-ornitina, un aminoacid non proteïc qu'estimula la sintèsi d'autres aminoacids essencials, coma una estrategia de gestion alternativa per melhorar las responsas molecularas, fisiologicas e bioquimicas de Phaseolus vulgaris L. al mòtle blanc causat per Pseudomonatio sclerum sclerum. D'experiéncias in vitro mostrèron que L-ornitina inhibiguèt significativament la creissença miceliala de S. pyrenoidosa d'un biais dependent de la dòsi. De mai, poiriá reduire significativament la severitat del mòtle blanc dins de condicions de sèrra. De mai, la L-ornitina estimulèt la creissença de las plantas tractadas, çò qu'indica que las concentracions testadas de L-ornitina èran pas fitotoxicas per las plantas tractadas. De mai, la L-ornitina aumentèt l'expression d'antioxidants non enzimatics (fenolics e flavonoïdes solubles totals) e d'antioxidants enzimatics (catalasa (CAT), peroxidasa (POX), e polifenòl oxidasa (PPO)), e aumentèt l'expression de tres gèns ligats a l'antioxidant (PSO1, PVGRAT, e PVGRAT). De mai, l'analisi in silico revelèt la preséncia d'una proteïna putativa oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) dins lo genòma de S. sclerotiorum, qu'èra fòrça similara a las proteïnas oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) d'Aspergillus fijiensis (AfOAH) e Penicillium sp. (PlOAH) en tèrmes d'analisi foncionala, de domenis conservats e de topologia. Curiosament, l'addicion de L-ornitina al mitan de bolhon de dextròsa de patata (PDB) diminuiguèt significativament l'expression del gèn SsOAH dins los micèlis de S. sclerotiorum. De manièra similara, l'aplicacion exogèna de L-ornitina diminuiguèt significativament l'expression del gèn SsOAH dins los micèlis fongics collectats de plantas tractadas. Fin finala, l'aplicacion de L-ornitina diminuiguèt significativament la secrecion d'acid oxalic dins lo mitan PDB e las fuèlhas infectadas. En conclusion, la L-ornitina jòga un ròtle clau per manténer l'estatut redox e tanben per melhorar la responsa de defensa de las plantas infectadas. Los resultats d'aqueste estudi pòdon ajudar a desvolopar de metòdes innovadors e respectuoses de l'environament per contrarotlar lo mòtle blanc e mitigar son impacte sus la produccion de mongetas e d'autras culturas.
Lo mòtle blanc, causat pel fong necrotròfic Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, es una malautiá devastatritz, que redutz lo rendement, que representa una menaça grèva per la produccion globala de mongeta (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum es un dels patogèns vegetals fongis transmeses pel sòl mai dificiles de contrarotlar, amb una granda gama d'òstes de mai de 600 espècias de plantas e la capacitat de macerar rapidament los teissuts òstes d'un biais non especific (Liang e Rollins, 2018). Dins de condicions desfavorablas, patís una fasa critica de son cicle de vida, en demorant dormida pendent de longs periòdes de temps coma d'estructuras negras, duras, en forma de granas nomenadas 'sclerotia' dins lo sòl o coma de creissenças blancas e peludas dins lo micèli o la tija de las plantas infectadas (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum es capable de formar d'esclerotia, çò que li permet de subreviure dins de camps infectats pendent de longs periòdes de temps e de persistir pendent la malautiá (Schwartz et al., 2005). Las esclerocias son ricas en nutriments, pòdon persistir dins lo sòl pendent de longs periòdes, e servisson d'inoculum primari per d'infeccions seguentas (Schwartz et al., 2005). Dins de condicions favorablas, las esclerocias germinan e produson d'espòras aerianas que pòdon infectar totas las partidas subreterrèlas de la planta, inclusent mas pas limitadas a de flors, de tijas o de pods (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum utiliza una estrategia multinivèl per infectar sas plantas òstes, implicant una tièra d'eveniments coordinats de la germinacion esclerotiala al desvolopament dels simptòmas. Inicialament, S. sclerotiorum produtz d'espòras suspendudas (nomenadas ascospòras) a partir d'estructuras semblablas a de bolets nomenadas apotècias, que venon en aire e se desvolopan en esclerocias non mobilas sus de degalhs vegetals infectats (Bolton et al., 2006). Lo fong secreta alara d'acid oxalic, un factor de viruléncia, per contrarotlar lo pH de la paret cellulara de la planta, promòure la degradacion enzimatica e l'invasion dels teissuts (Hegedus e Rimmer, 2005), e suprimir la peta oxidativa de la planta òste. Aqueste procès d'acidificacion afebli la paret cellulara de la planta, provesissent un environament favorable pel foncionament normal e eficient dels enzims degradants de la paret cellulara fongica (CWDEs), permetent al patogèn de superar la barrèra fisica e de penetrar los teissuts òste (Marciano et al., 1983). Un còp penetrat, S. sclerotiorum secreta un fum de CWDEs, coma la poligalacturonasa e la cellulasa, que facilitan sa difusion dins los teissuts infectats e causan la necròsi dels teissuts. La progression de las lesions e de las tapissas ifalas mena als simptòmas caracteristics del mòtle blanc (Hegedus e Rimmer, 2005). Mentretant, las plantas òstes reconeisson de modèls moleculars associats als patogèns (PAMPs) a travèrs de receptors de reconeissença de modèls (PRRs), en desencadenant una tièra d'eveniments de senhalament qu'activan finalament las responsas de defensa.
Malgrat de decennis d'esfòrces de contraròtle de malautiás, de mancas de germplasma resistent adequat demòran dins las mongetas, coma dins d'autras culturas comercialas, a causa de la resisténcia, la subrevida e l'adaptabilitat del patogèn. La gestion de la malautiá es doncas extrèmament desfisanta e demanda una estrategia integrada e multifacètica qu'inclutz una combinason de practicas culturalas, de contraròtle biologic e de fongicidas quimics (O'Sullivan et al., 2021). Lo contraròtle quimic del mòtle blanc es lo mai eficaç perque los fongicidas, quand son aplicats corrèctament e al bon moment, pòdon contrarotlar eficaçament la propagacion de la malautiá, reduire la severitat de l'infeccion, e minimizar las pèrdas de rendement. Pasmens, l'utilizacion excessiva e la dependéncia excessiva dels fongicidas pòdon menar a l'emergéncia de socas resistentas de S. sclerotiorum e impactar negativament los organismes non cibla, la santat del sòl e la qualitat de l'aiga (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Doncas, trobar d'alternativas respectuosas de l'environament es vengut una prioritat màger.
Las poliaminas (PAs), coma la putrescina, l'espermidina, l'espermina e la cadaverina, pòdon servir d'alternativas promesas contra los patogèns vegetals transmeses pel sòl, en redusent aital completament o parcialament l'utilizacion de fongicidas quimics perilhoses (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Dins las plantas superioras, los PA son implicats dins fòrça procèsses fisiologics inclusent, mas pas limitats a, la division cellulara, la diferenciacion, e la responsa a d'estrèsses abiotics e biòtics (Killiny e Nehela, 2020). Pòdon agir coma d'antioxidants, ajudar a escafar d'espècias d'oxigèn reactivas (ROS), manténer l'omeostasi redox (Nehela e Killiny, 2023), induire de gèns ligats a la defensa (Romero et al., 2018), regular divèrsas vias metabolicas (Nehela e Killiny, 2023), modular d'emomònas endogenòlas e etogenòlas (Nehela e Killiny, 2023) Killiny, 2019), establir la resisténcia aquerida sistemica (SAR), e regular las interaccions planta-patogèn (Nehela e Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Es de notar que los mecanismes e ròtles especifics dels PA dins la defensa de las plantas varian segon las espècias vegetalas, los patogèns e las condicions environamentalas. L'AP mai abondant dins las plantas es biosintetizat a partir de la poliamina essenciala L-ornitina (Killiny e Nehela, 2020).
La L-ornitina jòga de ròtles multiples dins la creissença e lo desvolopament de las plantas. Per exemple, d'estudis precedents an mostrat que dins l'arròs (Oryza sativa), l'ornitina pòt èsser associada al reciclatge d'azòt (Liu et al., 2018), al rendement de l'arròs, a la qualitat e a l'aroma (Lu et al., 2020), e a la responsa a l'estrès d'aiga (Yang et al., 2000). De mai, l'aplicacion exogèna de L-ornitina aumentèt significativament la tolerància a la secada dins la remolatxa de sucre (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) e alleujèt l'estrès de sal dins la ceba (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu e Çavuşoǧlu, 2021) e la planta d'occina (Accida) Rocha et al., 2012). Lo ròtle potencial de L-ornitina dins la defensa de l'estrès abiotic pòt èsser degut a son implicacion dins l'acumulacion de prolina dins las plantas tractadas. Per exemple, de gèns ligats al metabolisme de la prolina, coma los gèns de l'ornitina delta aminotransferasa (delta-OAT) e de la desidrogenasa de la prolina (ProDH1 e ProDH2), son estats reportats prèviament per èsser implicats dins la defensa de Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana contra las socas de Pseudomonas non òstes (Kumare, e Mysore 2012). D'un autre costat, l'ornitina decarboxilasa fongica (ODC) es necessària per la creissença dels patogèns (Singh et al., 2020). Ciblant ODC de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via lo silenci de gèns induch per l'òste (HIGS) aumentèt significativament la resisténcia de las plantas de tomata a la marcitacion de Fusarium (Singh et al., 2020). Pasmens, lo ròtle potencial de l'aplicacion d'ornitina exogèna contra d'estrèsses biotics coma los fitopatogèns es pas estat plan estudiat. Mai importantament, los efièches de l'ornitina sus la resisténcia a las malautiás e los fenomèns bioquimics e fisiologics associats demòran largament inexplorats.
Comprene la complexitat de l'infeccion per S. sclerotiorum de las leguminosas es important pel desvolopament d'estrategias de contraròtle eficaças. Dins aqueste estudi, volèrem identificar lo ròtle potencial de la diamina L-ornitina coma un factor clau per melhorar los mecanismes de defensa e la resisténcia de las plantas de leguminosas a l'infeccion Sclerotinia sclerotiorum. Ipotèsiam que, en mai de melhorar las responsas de defensa de las plantas infectadas, la L-ornitina jòga tanben un ròtle clau per manténer l'estatut redox. Prepausam que los efièches potencials de L-ornitina son ligats a la regulacion dels mecanismes de defensa antioxidant enzimatics e non enzimatics e a l'interferéncia amb los factors de patogènia/viruléncia fongica e de proteïnas associadas. Aquesta dobla foncionalitat de L-ornitina ne fa un candidat prometeire per una estrategia sostenibla per mitigar l'impacte del mòtle blanc e melhorar la resisténcia de las culturas de leguminosas comunas a aquel potent patogèn fongic. Los resultats de l'estudi present pòdon ajudar al desvolopament de metòdes innovadors e respectuoses de l'environament per contrarotlar lo mòtle blanc e mitigar son impacte sus la produccion de leguminosas.
Dins aqueste estudi, una varietat comerciala susceptibla de mongeta comuna, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), foguèt utilizada coma material experimental. De granas sanas foguèron gentilment provesidas pel Departament de Recèrca de Leguminosas, Institut de Recèrca de Cultius de Camp (FCRI), Centre de Recèrca Agricòla (ARC), Egipte. Cinc granas foguèron semenadas dins de pòts de plastic (diamètre interior 35 cm, prigondor 50 cm) emplenats de sòl infectat per S. sclerotiorum jos condicions de sèrra (25 ± 2 °C, umiditat relativa 75 ± 1%, 8 h de lutz/16 h escur). A 7-10 jorns après la semenada (DPS), las plantas foguèron aprimadas per daissar pas que doas plantas amb una creissença unifòrma e tres fuèlhas completament espandidas dins cada pot. Totas las plantas en pòts foguèron arrosadas un còp cada doas setmanas e fecondadas mensualament al taus recomandat per la varietat donada.
Per preparar una concentracion de 500 mg/L de L-ornithinediamina (tanben coneguda coma (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha), 50 mg foguèron d'en primièr dissolguts dins 100 mL d'aiga destillada esterila. La solucion de basa foguèt alara diluida e utilizada dins d'experiéncias seguentas. Brevament, sièis serias de concentracions de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100, e 125 mg/L) foguèron testadas in vitro. De mai, l'aiga destillada esterila foguèt utilizada coma contraròtle negatiu (Mock) e lo fongicida comercial "Rizolex-T" 50% de polvera humidable (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governate, Egy) foguèt utilizat coma contraròtle positiu. Lo fongicida comercial "Rizolex-T" foguèt testat in vitro a cinc concentracions (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L).
De mòstras de tijas de mongeta comunas e de pods mostrant de simptòmas tipics de mòtle blanc (taus d'infestacion: 10-30%) foguèron collectats de granjas comercialas. E mai se la màger part dels materials vegetals infectats foguèron identificats per espècia/varietat (varietat comerciala susceptibla Giza 3), d'autres, mai que mai aqueles obtenguts dels mercats locals, èran d'espècias desconegudas. Los materials infectats collectats foguèron d'en primièr desinfectats en superfícia amb una solucion d'ipoclorit de sòdi a 0,5% pendent 3 minutas, puèi rinçats divèrsas còps amb d'aiga destillada esteril e escombrats secs amb de papièr de filtre esteril per levar l'excès d'aiga. Los organs infectats foguèron alara talhats en pichons tròces del teissut mejan (entre los teissuts sans e infectats), cultivats sus un mitan d'agar de dextròsa de patata (PDA) e incubats a 25 ± 2 °C amb un cicle de 12 oras de lutz/12 oras d'escur pendent 5 jorns per estimular la formacion d'esclerocia. Lo metòde de punta miceliala foguèt tanben utilizat per purificar d'isolats fongics de culturas mescladas o contaminadas. L'isolat fongic purificat foguèt d'en primièr identificat en foncion de sas caracteristicas morfologicas culturalas e puèi confirmat coma S. sclerotiorum en foncion de caracteristicas microscopicas. Fin finala, totes los isolats purificats foguèron testats per la patogenicitat sul cultivar de mongeta comuna susceptibla Giza 3 per respondre als postulats de Koch.
De mai, l'isolat S. sclerotiorum mai invasiu (isolat #3) foguèt mai confirmat en foncion del sequenciatge de l'espaciador transcrich intèrne (ITS) coma descrich per White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Brevament, los isolats foguèron cultivats dins de bolhon de dextròsa de patata (PDB) e incubats a 25 ± 2 °C pendent 5–7 jorns. Lo micèli fongic foguèt alara collectat, filtrat a travèrs de drap de formatge, lavat dos còps amb d'aiga esterila, e secat amb de papièr de filtre estèril. L'ADN genomic foguèt isolat en utilizant lo Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). La region d'ADNr ITS foguèt alara amplificada en utilizant lo parelh d'amorçaire especific ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; talha esperada: 540 pb) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Los produches PCR purificats foguèron someses per sequénciament (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Las sequéncias d'ADNr ITS foguèron sequénciadas bidireccionalament en utilizant lo metòde de sequénciament de Sanger. Las sequéncias de requèstas assembladas foguèron alara comparadas amb las darrièras donadas de GenBank e del Centre Nacional d'Informacion Biotecnologica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) en utilizant lo logicial BLASTn. La sequéncia de requèsta foguèt comparada amb 20 autras socas/isolats de S. sclerotiorum recuperats de las darrièras donadas dins NCBI GenBank (Taula suplementària S1) en utilizant ClustalW dins lo paquet d'analisi de la genetica evolucionària moleculara (MEGA-11; version 11) (Kumar et al., 2024). L'analisi evolutiva foguèt realizada en utilizant lo metòde de probabilitat maximala e lo modèl general de substitucion de nucleotids reversible dins lo temps (Nei e Kumar, 2000). L'arbre amb la probabilitat logaritmica mai nauta es mostrat. L'arbre inicial per la recèrca euristica es seleccionat en causissent l'arbre amb la probabilitat logaritmica mai nauta entre l'arbre de jonccion de vesin (NJ) (Kumar et al., 2024) e l'arbre de parsimonia maximala (MP). L'arbre NJ foguèt bastit en utilizant una matriça de distància per parelhs calculada en utilizant lo modèl general reversible al temps (Nei e Kumar, 2000).
L'activitat antibacteriana de L-ornitina e del bactericida "Rizolex-T" foguèt determinada in vitro pel metòde de difusion d'agar. Metòde: Prenètz la quantitat apropriada de la solucion de L-ornitina (500 mg/L) e la mesclatz plan amb 10 ml del mitan nutritiu PDA per preparar de solucions amb de concentracions finalas de 12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L, respectivament. Cinc concentracions del fongicida "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L) e d'aiga destillada esterila foguèron utilizadas coma contraròtle. Après que lo mitan s'èra solidificat, un tap micelial recentament preparat de cultura Sclerotinia sclerotiorum, de 4 mm de diamètre, foguèt transferit al centre del plat de Petri e cultivat a 25±2°C fins que lo micèli cobriguèsse l'ensemble del plat de Petri de contraròtle, après que la creissença fongica foguèt enregistrada. Calculatz lo percentatge d'inibicion de la creissença radiala de S. sclerotiorum en utilizant l'equacion 1:
L'experiéncia foguèt repetida dos còps, amb sièis replicas biologicas per cada grop de contraròtle/experimental e cinc pòts (doas plantas per pòt) per cada replicat biologic. Cada replicat biologic foguèt analizat dos còps (dos replicats tecnics) per assegurar la precision, la fiabilitat e la reproductibilitat dels resultats experimentals. De mai, l'analisi de regression probit foguèt utilizada per calcular la concentracion inibitòria mièg-maximala (IC50) e IC99 (Prentice, 1976).
Per avalorar lo potencial de L-ornitina dins de condicions de sèrra, doas experiéncias de pòts consecutivas foguèron menadas. Brevament, los pòts foguèron emplenats de sòl argila-sable esterilizat (3:1) e inoculats amb una cultura recentament preparada de S. sclerotiorum. D'en primièr, l'isolat mai invasor de S. sclerotiorum (isolat #3) foguèt cultivat en talhant un escleroti per la mitat, en lo plaçant cara aval sus un PDA e en incubant a 25°C dins l'escur constant (24 oras) pendent 4 jorns per estimular la creissença miceliala. Quatre taps d'agar de 5 mm de diamètre foguèron alara preses del bòrd d'avantatge e inoculats amb 100 g d'una mescla esterila de blat e de bran d'arròs (1:1, v/v) e totes los flascs foguèron incubats a 25 ± 2 °C jos un cicle de 12 oras de lutz/12 oras d'escur pendent 5 jorns per estimular la formacion de scleròcias. Lo contengut de totes los flascs foguèt plan mesclat per assegurar l'omogeneïtat abans d'apondre de sòl. Puèi, 100 g de la mescla de segal colonizator foguèron aponduts a cada pòt per assegurar una concentracion constanta de patogèns. Los pòts inoculats foguèron arrosats per activar la creissença fongica e plaçats dins de condicions de sèrra pendent 7 jorns.
Cinc granas de la varietat Giza 3 foguèron alara semenadas dins cada pot. Pels pòts tractats amb L-ornitina e lo fongicida Rizolex-T, las granas esterilizadas foguèron d'en primièr trempadas pendent doas oras dins una solucion aquosa dels dos compausats amb una concentracion finala d'IC99 d'aperaquí 250 mg/L e 50 mg/L, respectivament, e puèi secadas a l'aire pendent una ora abans la semenada. D'un autre costat, las granas foguèron trempadas dins d'aiga destillada esterila coma contraròtle negatiu. Après 10 jorns, abans la primièra rega, las plantas foguèron aprimadas, en daissant pas que doas plantas polidas dins cada pòt. De mai, per assegurar l'infeccion amb S. sclerotiorum, las tijas de plantas de mongeta al meteis estadi de desvolopament (10 jorns) foguèron talhadas a dos endreches diferents en utilizant un bisturí esterilizat e aperaquí 0,5 g de la mescla de bran colonizator foguèt plaçat dins cada nafra, seguit d'una umiditat nauta per estimular l'infeccion e la malautiá e totas las plantas infectadas. Las plantas de contraròtle foguèron feridas de manièra similara e una quantitat egala (0,5 g) de mescla de segal esterila e non colonizada foguèt plaçada dins la nafra e mantenguda jos una umiditat nauta per simular l'environament pel desvolopament de la malautiá e assegurar la coeréncia entre los grops de tractament.
Metòde de tractament: Las plantas de mongetas foguèron arrosadas amb 500 ml d'una solucion aquosa de L-ornitina (250 mg/l) o lo fongicida Rizolex-T (50 mg/l) en irrigant lo sòl, puèi lo tractament foguèt repetit tres còps a un interval de 10 jorns. Los contraròtles tractats amb placebo foguèron irrigats amb 500 ml d'aiga destillada esterila. Totes los tractaments foguèron menats a tèrme dins de condicions de sèrra (25 ± 2°C, 75 ± 1% d'umiditat relativa, e un fotoperiòde de 8 h de lutz/16 h d'escur). Totes los pòts èran arrosats cada quinzenal e tractats mensualament amb un engrais NPK equilibrat (20-20-20, amb 3,6% de sofre e de microelements TE; Zain Seeds, Egipte) a una concentracion de 3–4 g/l per pulverizacion foliara segon las recomandacions de la varietat especifica e las instruccions de fabricacion. Levat se indicat çò contrari, de fuèlhas maduras entièrament espandidas (2a e 3a fuèlhas de naut) foguèron collectadas de cada replicat biologic a 72 oras après tractament (hpt), omogeneizadas, amassadas e emmagazinadas a -80 °C per d'analisis suplementàrias inclusent, mas pas limitadas a, la localizacion istoquimica in situ dels indicators d'estrès oxidant, de l'indicacion peroxidatica e enzidatica antioxidants non enzimatics e expression genica.
L'intensitat de l'infeccion de mòtle blanc foguèt avalorada setmanièrament 21 jorns après l'inoculacion (dpi) en utilizant una escala de 1-9 (Taula suplementària S2) basada sus l'escala de Petzoldt e Dickson (1996) modificada per Teran et al. (2006). Brevament, las tijas e las brancas de las plantas de mongetas foguèron examinadas a partir del punt d'inoculacion per seguir la progression de las lesions al long dels internòdes e dels nœuds. La distància de la lesion del ponch d'inoculacion al ponch mai luènh lo long de la tija o de la branca foguèt alara mesurada e una nòta de 1-9 foguèt assignada en foncion de l'emplaçament de la lesion, ont (1) indiquèt pas cap d'infeccion visibla prèp del ponch d'inoculacion e (2-9) indiquèt un aument gradual de la talha de la lesion e de la progression al long dels nœuds internòdes (Taula S2). L'intensitat d'infeccion de mòtle blanc foguèt alara convertida en percentatge en utilizant la formula 2:
De mai, l'airal jos la corba de progression de la malautiá (AUDPC) foguèt calculat en utilizant la formula (Shaner e Finney, 1977), qu'èra recentament adaptada per la poiridura blanca de mongetas comunas (Chauhan et al., 2020) en utilizant l'equacion 3:
Ont Yi = severitat de la malautiá al moment ti, Yi+1 = severitat de la malautiá al moment seguent ti+1, ti = temps de primièra mesura (en jorns), ti+1 = temps de mesura seguenta (en jorns), n = nombre total de punts de temps o de punts d'observacion. Los paramètres de creissença de la planta de mongeta inclusent la nautor de la planta (cm), lo nombre de brancas per planta, e lo nombre de fuèlhas per planta foguèron enregistrats setmanièrament pendent 21 jorns dins totes los replicats biologics.
Dins cada replicat biologic, de mòstras de fuèlhas (segonda e tresena fuèlhas completament desvolopadas dempuèi lo naut) foguèron collectadas lo jorn 45 après lo tractament (15 jorns après lo darrièr tractament). Cada rèplica biologica consistissiá en cinc pòts (doas plantas per pòt). Aperaquí 500 mg del teissut esclafat foguèron utilizats per l'extraccion de pigments fotosintetics (clorofila a, clorofila b e carotenoïdes) en utilizant 80% d'acetona a 4 °C dins l'escur. Après 24 oras, los mòstras foguèron centrifugats e lo subrenatant foguèt collectat per la determinacion dels contenguts de clorofilla a, clorofila b e de carotenoïdes colorimetricament en utilizant un espectrofotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon) segon lo metòde de (Lichtenthaler, 1987) en mesurant las longors d'onda diferentas (A470, A646 e A663 nm). Fin finala, lo contengut de pigments fotosintetics foguèt calculat en utilizant las formulas 4-6 seguentas descrichas per Lichtenthaler (1987).
A 72 h après tractament (hpt), de fuèlhas (segonda e tresena fuèlhas completament desvolopadas dempuèi lo naut) foguèron collectadas de cada replicat biologic per la localizacion istoquimica in situ del peroxid d'idrogèn (H2O2) e de l'anion de superoxid (O2•−). Cada rèplica biologica consistissiá en cinc pòts (doas plantas per pòt). Cada replicat biologic foguèt analizat en doble (dos replicats tecnics) per assegurar la precision, la fiabilitat e la reproductibilitat del metòde. H2O2 e O2•− foguèron determinats en utilizant 0,1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) o nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha), respectivament, en seguint los metòdes descriches per Romero-Puertas et al. (2004) e Adam et al. (1989) amb de modificacions menoras. Per la localizacion istoquimica de H2O2 in situ, los fuèlhs foguèron infiltrats al vuèg amb 0,1% DAB dins un tampon Tris 10 mM (pH 7,8) e puèi incubats a temperatura ambienta dins la lutz pendent 60 min. Los fuèlhs foguèron blanquits dins 0,15% (v/v) TCA dins 4:1 (v/v) etanòl:cloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Caire, Egipte) e puèi expausats a la lutz fins que s'escurciguèron. De manièra similara, las valvas foguèron infiltradas al vuèg amb un tampon de fosfat de potassi 10 mM (pH 7,8) contenent 0,1 p/v % HBT per la localizacion istoquimica d'O2•− in situ. Los fuèlhs foguèron incubats dins la lutz a temperatura ambienta pendent 20 min, puèi blanquits coma çai-sus, e puèi esclairats fins que de tacas blau escur/violet apareguèsson. L'intensitat de la color marron (coma indicator H2O2) o blau-violet (coma indicator O2•−) resultanta foguèt avalorada en utilizant la version Fiji del paquet de tractament d'imatges ImageJ (http://fiji.sc; accedit lo 7 de març de 2024).
Lo malondialdeïd (MDA; coma marcador de peroxidacion lipida) foguèt determinat segon lo metòde de Du e Bramlage (1992) amb de modificacions leugièras. Las fuèlhas de cada replicat biologic (segonda e tresena fuèlhas completament desvolopadas dempuèi lo naut) foguèron collectadas 72 oras après tractament (hpt). Cada rèplica biologica inclusiá cinc pòts (doas plantas per pòt). Cada replicat biologic foguèt analizat en doble (dos replicats tecnics) per assegurar la precision, la fiabilitat e la reproductibilitat del metòde. En resumit, 0,5 g de teissut de fuèlha mòlta foguèt utilizat per l'extraccion de MDA amb 20% d'acid tricloroacetic (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) contenent 0,01% d'idroxitoluèn butilat (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Lo contengut MDA dins lo subrenatant foguèt alara determinat colorimetricament en mesurant l'absorbància a 532 e 600 nm en utilizant un espectrofotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon) e puèi exprimit coma nmol g−1 FW.
Per l'avaloracion dels antioxidants non enzimatics e enzimatics, de fuèlhas (segonda e tresena fuèlhas completament desvolopadas dempuèi lo naut) foguèron collectadas de cada replicat biologic a 72 oras après tractament (hpt). Cada rèplica biologica consistissiá en cinc pòts (doas plantas per pòt). Cada mòstra biologica foguèt analizada en doble (dos mòstras tecnicas). Doas fuèlhas foguèron mòltas amb d'azòt liquid e utilizadas dirèctament per la determinacion dels antioxidants enzimatics e non enzimatics, dels aminoacids totals, del contengut de prolina, de l'expression genica e de la quantificacion de l'oxalat.
Los fenòls solubles totals foguèron determinats en utilizant lo reactiu Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) amb de leugièras modificacions del metòde descrich per Kahkonen et al. (1999). En resumit, aperaquí 0,1 g de teissut de fuèlha omogeneizat foguèt extrach amb 20 ml de metanòl a 80% dins l'escur pendent 24 oras e lo subrenatant foguèt collectat après centrifugacion. 0,1 ml de l'extrach de mòstra foguèt mesclat amb 0,5 ml de reactiu Folin-Ciocalteu (10%), agitat pendent 30 s e daissat dins l'escur pendent 5 min. Puèi 0,5 ml de solucion de carbonat de sòdi a 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Caire, Egipte) foguèt apondut a cada tub, mesclat a fons e incubat a temperatura ambienta dins l'escur pendent 1 h. Après incubacion, l'absorbància de la mescla de reaccion foguèt mesurada a 765 nm en utilizant un espectrofotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). La concentracion de fenòls solubles totals dins los extraches de mòstra foguèt determinada en utilizant una corba d'etalonatge d'acid galic (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) e exprimida en miligramas d'equivalent d'acid galic per grama de pes fresc (mg GAE g-1 pes fresc).
Lo contengut total de flavonoïdes solubles foguèt determinat segon lo metòde de Djeridane et al. (2006) amb de modificacions leugièras. Brevament, 0,3 ml de l'extrach de metanòl susmencionat foguèt mesclat amb 0,3 ml de solucion de clorur d'alumini a 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), vigorosament agitats e puèi incubat a temperatura ambienta pendent 5 min, seguit de l'apond de 0,3 ml de solucion d'assitic 10% d'assitic d'assitic. (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), plan mesclat e incubat a temperatura ambienta pendent 30 min dins l'escur. Après incubacion, l'absorbància de la mescla de reaccion foguèt mesurada a 430 nm en utilizant un espectrofotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). La concentracion de flavonoïdes solubles totals dins los extraches de mòstra foguèt determinada en utilizant una corba d'etalonatge de rutina (TCI America, Portland, OR, USA) e puèi exprimida en miligramas d'equivalent de rutina per grama de pes fresc (mg RE g-1 pes fresc).
Lo contengut total d'acids aminats liures de las fuèlhas de mongeta foguèt determinat en utilizant un reactiu de ninhidrina modificat (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) basat sul metòde prepausat per Yokoyama e Hiramatsu (2003) e modificat per Sun et al. (2006). Brevament, 0,1 g de teissut mòlt foguèt extrach amb un tampon de pH 5,4, e 200 μL del subrenadant foguèt reagit amb 200 μL de ninhidrina (2%) e 200 μL de piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), incubat dins un banh d'aiga bolhenta pendent un banh d'aiga bolhenta e refrejat puèi 30 min a 580 nm en utilizant un espectrofotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). D'un autre costat, la prolina foguèt determinada pel metòde Bates (Bates et al., 1973). La prolina foguèt extracha amb 3% d'acid sulfosalicilic (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) e après centrifugacion, 0,5 ml del subrenatant foguèt mesclada amb 1 ml d'acid acetic glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) e de reactiu de ninidrina, incubat a 90°C, e cool minut mesurat a 520 nm en utilizant lo meteis espectrofotomètre que çai-sus. Los aminoacids liures totals e la prolina dins los extraches de fuèlhas foguèron determinats en utilizant de corbas d'etalonatge de glicina e de prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), respectivament, e exprimits coma mg/g de pes fresc.
Per determinar l'activitat enzimatica dels enzims antioxidants, aperaquí 500 mg de teissut omogeneizat foguèron extraches amb 3 ml de tampon Tris 50 mM (pH 7,8) contenent 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 7,5% de polipirolidona (PP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugat a 10 000 × g pendent 20 min jos refrigeracion (4 °C), e lo subrenatant (extrach d'enzim brut) foguèt collectat (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). La catalasa (CAT) foguèt alara reagida amb 2 ml de tampon de fosfat sòdi 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 100 μl de solucion de H2O2 269 mM per determinar son activitat enzimatica segon lo metòde d'Aebi (1984) amb de modificacions d'Ellight-Nagar et al. 2023; Osman et al., 2023). L'activitat enzimatica de la peroxidasa dependenta de guaiacol (POX) foguèt determinada en utilizant lo metòde de Harrach et al. (2009). (2008) amb de modificacions minoras (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) e l'activitat enzimatica de la polifenòl oxidasa (PPO) foguèt determinada après reaccion amb 2,2 ml de tampon de fosfat de sòdi 100 mM (pH 6,00 mM), de substàncias quimicas (CI, 100 μT, CI. Portland, OR, USA) e 100 μl de 12 mM H2O2. Lo metòde foguèt leugièrament modificat a partir de (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). L'assaig foguèt realizat après reaccion amb 3 ml de solucion de catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) recentament preparat dins un tampon fosfat 0,1 M (pH 6,0). L'activitat CAT foguèt mesurada en susvelhant la descomposicion de H2O2 a 240 nm (A240), l'activitat POX foguèt mesurada en susvelhant l'aument de l'absorbància a 436 nm (A436), e l'activitat PPO foguèt mesurada en enregistrant de fluctuacions d'absorbància a 495 nm (A495) cada 30 s pendent 30 min en utilizant un aspècte UV-1600 (Shimadzu, Japon).
La RT-PCR en temps real foguèt utilizada per detectar los nivèls de transcripcion de tres gèns ligats als antioxidants, dont la catalasa peroxisomala (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), la superoxid dismutasa (PvSOD; GenBank Accession No. XM_0686395), e la glutasa reducta (GenBank; Accession No. KY195009.1), dins de fuèlhas de mongeta (la segonda e tresena fuèlhas completament desvolopadas dempuèi lo naut) 72 h après lo darrièr tractament. En resumit, l'ARN foguèt isolat en utilizant lo Kit d'Extraccion d'ARN Total Simply P (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) segon lo protocòl del fabricant. Puèi, l'ADNc foguèt sintetizat en utilizant lo Kit de sintèsi d'ADNc TOP scriptTM segon las instruccions del fabricant. Las sequéncias d'amorçadors dels tres gèns susmencionats son listadas dins lo tablèu suplementari S3. PvActin-3 (numèro d'accesion GenBank: XM_068616709.1) foguèt utilizat coma gèn de menatge e l'expression genica relativa foguèt calculada en utilizant lo metòde 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001). L'estabilitat de l'actina jos estrès biotic (interaccion incompatibla entre leguminosas comunas e lo fong antracnós Colletotrichum lindemuthianum) e estrès abiotic (secada, salinitat, temperatura bassa) foguèt demostrada (Borges et al., 2012).
Inicialament realizèrem una analisi in silico a l'ensems del genòma de las proteïnas oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) dins S. sclerotiorum en utilizant l'aisina proteïna-proteïna BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). En resumit, avèm utilizat OAH d'Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxid: 1191702; numèro d'accès de GenBank XP_040799428.1; 342 acids aminats) e Penicillium lagena (PlOAH; taxid: 942181; numèro d'accès de GenBank; XP_056833920.1; 316 aminoacids) coma sequéncias de requèsta per cartografiar la proteïna omològa dins S. sclerotiorum (taxid: 5180). BLASTp foguèt realizat contra las donadas de genòma de S. sclerotiorum mai recentament disponiblas dins GenBank sul sit web del Centre Nacional d'Informacion Biotecnologica (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
De mai, lo gèn OAH predich de S. sclerotiorum (SsOAH) e l'analisi evolutiva e l'arbre filogenetic d'AfOAH de A. fijiensis CBS 313.89 e PlOAH de P. lagena foguèron inferits en utilizant lo metòde de probabilitat maximala dins MEGA11 (Tamura et al., 2021) e lo modèl basat sus JTT (JTT et et. al., 1992). L'arbre filogenetic foguèt combinat amb l'analisi d'alinhament multiple de las sequéncias de proteïnas de totes los gèns OAH prevists (SsOAH) de S. sclerotiorum e la sequéncia de requèsta en utilizant l'aisina d'alinhament basada sus las contraintes (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt. Agarwala, 2007). De mai, las sequéncias d'aminoacids melhor correspondentas de SsOAH de S. sclerotiorum foguèron alinhadas amb las sequéncias de requèsta (AfOAH e PlOAH) (Larkin et al., 2007) en utilizant ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), e las regions conservadas foguèron alinhadas en utilizant l'ESP aisina (version 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
De mai, los domenis representatius foncionals prevists e los sites conservats de S. sclerotiorum SsOAH foguèron interactivament classats en diferentas familhas en utilizant l'aisina InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Fin finala, la modelizacion d'estructura tridimensionala (3D) del SsOAH previst de S. sclerotiorum foguèt realizada en utilizant lo Motor de reconeissença d'omologia/analogia de proteïnas (version 2.0 del servidor Phyre2; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.c.gid=index) (Kelley et al., et al. 2015) e validat en utilizant lo servidor SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Las estructuras tridimensionalas previstas (format PDB) foguèron interactivament visualizadas en utilizant lo paquet UCSF-Chimera (version 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
La PCR quantitativa de fluorescéncia en temps real foguèt utilizada per determinar lo nivèl de transcripcion de l'oxaloacetat acetilidrolasa (SsOAH; numèro d'accès de GenBank: XM_001590428.1) dins lo micèli de Sclerotinia sclerotiorum. Brevament, S. sclerotiorum foguèt inoculat dins un matras que conteniá PDB e plaçat dins una incubatritz tremolanta (modèl: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) a 25 ± 2 °C pendent 24 oras a 150 rpm e dins l'escur constant (24 oras) per estimular la creissença miceliana. Après, las cellulas foguèron tractadas amb L-ornitina e lo fongicida Rizolex-T a de concentracions finalas d'IC50 (aperaquí 40 e 3,2 mg/L, respectivament) e puèi cultivadas pendent 24 oras mai dins las meteissas condicions. Après incubacion, las culturas foguèron centrifugadas a 2500 rpm pendent 5 min e lo subrenatant (micèli fongic) foguèt collectat per l'analisi de l'expression genica. De manièra similara, lo micèli fongic foguèt collectat a 0, 24, 48, 72, 96 e 120 oras après l'infeccion de plantas infectadas qu'avián format de mòtle blanc e de micèli cotonós sus la superfícia dels teissuts infectats. L'ARN foguèt extrach del micèli fongic e puèi l'ADNc foguèt sintetizat coma descrich çai-sus. Las sequéncias d'amorçadors per SsOAH son listadas dins lo tablèu suplementari S3. SsActin (numèro d'accès GenBank: XM_001589919.1) foguèt utilizat coma gèn de menatge, e l'expression genica relativa foguèt calculada en utilizant lo metòde 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001).
L'acid oxalic foguèt determinat dins de bolhons de dextròsa de patata (PDB) e de mòstras de plantas que contenián lo patogèn fongic Sclerotinia sclerotiorum segon lo metòde de Xu e Zhang (2000) amb de leugièras modificacions. Brevament, los isolats de S. sclerotiorum foguèron inoculats dins de flascs que contenián de PDB e puèi cultivats dins una incubadora tremolanta (modèl I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) a 150 rpm a 25 ± 2 °C pendent 3–5 jorns dins l'escur constant (24 oras) per estimular la creissença micelica. Après incubacion, la cultura fongica foguèt d'en primièr filtrada a travèrs de papièr de filtre Whatman #1 e puèi centrifugada a 2500 rpm pendent 5 min per levar lo micèli residual. Lo subrenatant foguèt collectat e emmagazinat a 4°C per una determinacion quantitativa suplementària de l'oxalat. Per la preparacion de mòstras de plantas, aperaquí 0,1 g de fragments de teissut vegetal foguèron extraches tres còps amb d'aiga destilada (2 ml cada còp). Los mòstras foguèron alara centrifugats a 2500 rpm pendent 5 min, lo subrenadant foguèt filtrat a sec a travèrs de papièr de filtre Whatman No. 1 e collectat per una analisi mai prigonda.
Per l'analisi quantitativa de l'acid oxalic, la mescla de reaccion foguèt preparada dins un tub de veire tampat dins l'òrdre seguent: 0,2 ml de mòstra (o filtrat de cultura PDB o solucion estandard d'acid oxalic), 0,11 ml de blau de bromofenòl (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburghburgh, USA, Ml 1919), Ml. acid sulfuric (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Caire, Egipte) e 0,176 ml de 100 mM de dicromat de potassi (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), e puèi la solucion foguèt diluida a 48 mM d'aiga distilada, mesclada vigorosament. immediatament plaçat dins un banh d'aiga a 60 °C. Après 10 min, la reaccion foguèt arrestada en apondent 0,5 ml de solucion d'idròxid de sòdi (NaOH; 0,75 M). L'absorbància (A600) de la mescla de reaccion foguèt mesurada a 600 nm en utilizant un espectrofotomètre UV-160 (Shimadzu Corporation, Japon). PDB e aiga destillada foguèron utilizats coma contraròtles per la quantificacion dels filtrats de cultura e de las mòstras de plantas, respectivament. Las concentracions d'acid oxalic dins los filtrats de cultura, exprimidas en microgramas d'acid oxalic per millilitre de mitan PDB (μg.mL−1), e dins los extraches de fuèlhas, exprimidas en microgramas d'acid oxalic per grama de pes fresc (μg.g−1 FW), foguèron determinadas en utilizant una corba d'acid oxalic cabra (The Firmors Quimicas scientificas, Waltham, MA, EUA).
Al cors de l'estudi, totas las experiéncias foguèron concebudas dins un dessenh completament aleatòri (CRD) amb sièis replicas biologicas per tractament e cinc pòts per replicat biologic (doas plantas per pòt) levat se s'indica lo contrari. Las replicas biologicas foguèron analizadas en doble (doas replicas tecnicas). De replicas tecnicas foguèron utilizadas per verificar la reproductibilitat de la meteissa experiéncia mas foguèron pas utilizadas dins l'analisi estatistica per evitar de replicas espurias. Las donadas foguèron analizadas estatisticament en utilizant l'analisi de variança (ANOVA) seguida del tèst de diferéncia onèstament significativa (HSD) de Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Per d'experiéncias in vitro, las valors IC50 e IC99 foguèron calculadas en utilizant lo modèl probit e d'intervals de confiéncia de 95% foguèron calculats.
Un total de quatre isolats foguèron collectats de diferents camps de sòja dins lo Governorat d'El Ghabiya, Egipte. Sul mitan PDA, totes los isolats produsiguèron de micèli blanc cremós que venguèt rapidament blanc cotonós (Figura 1A) e puèi beige o brun a l'estadi d'escleroci. Las esclerocias son generalament densas, negras, esfericas o irregularas de forma, de 5,2 a 7,7 mm de long e de 3,4 a 5,3 mm de diamètre (Figura 1B). E mai se quatre isolats desvolopèron un modèl marginal d'esclerocias al bòrd del mitan de cultura après 10–12 jorns d'incubacion a 25 ± 2 °C (Fig. 1A), lo nombre d'esclerocias per placa èra significativament diferent entre eles (P < 0,001), amb l'isolat 3 avent lo nombre mai naut d'esclerocias (353 ± 33.33). esclerocia per placa; Fig. 1C). De manièra similara, l'isolat #3 produsiguèt mai d'acid oxalic dins PDB que d'autres isolats (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). L'isolat #3 mostrèt de caracteristicas morfologicas e microscopicas tipicas del fong fitopatogen Sclerotinia sclerotiorum. Per exemple, sus PDA, las colonias d'isolat #3 creissián rapidament, èran blancs cremós (Figura 1A), beige invèrs o jaune-marron salmon clar, e demandèron 6-7 jorns a 25 ± 2°C per cobrir completament la superfícia d'una placa de 9 cm de diamètre. En foncion de las caracteristicas morfologicas e microscopicas susmencionadas, l'isolat #3 foguèt identificat coma Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Caracteristicas e patogenicitat dels isolats de S. sclerotiorum de culturas de leguminosas comunas. (A) Creissença miceliana de quatre isolats de S. sclerotiorum sus mitan PDA, (B) esclerocias de quatre isolats de S. sclerotiorum, (C) nombre d'esclerocias (per placa), (D) secrecion d'acid oxalic sus mitan PDB (μg.mL−1), e (E) severitat de la malautiá (%) de quatre isolats de S. sclerotiorum sus de patas comercialas susceptibles sus las cambas comercialas. cultivar Giza 3 en condicions de sèrra. Las valors representan la mejana ± DS de cinc replicas biologicas (n = 5). De letras diferentas indican de diferéncias estatisticament significativas entre los tractaments (p < 0,05). (F–H) De simptòmas tipics de mòtle blanc apareguèron sus de tijas e de silicas subreterranhas, respectivament, 10 jorns après l'inoculacion amb l'isolat #3 (dpi). (I) L'analisi evolutiva de la region de l'espaciador transcrich intèrne (ITS) de l'isolat #3 de S. sclerotiorum foguèt realizada en utilizant lo metòde de probabilitat maximala e comparada amb 20 isolats/socas de referéncia obtenguts de la basa de donadas del Centre Nacional d'Informacion Biotecnologica (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.h.v/). Los nombres al dessús de las linhas d'agropament indican la cobertura de la region (%), e los nombres en dejós de las linhas d'agropament indican la longor de la branca.
De mai, per confirmar la patogenicitat, quatre isolats de S. sclerotiorum obtenguts foguèron utilizats per inocular lo cultivar de mongeta comerciala susceptibla Giza 3 jos condicions de sèrra, çò qu'es coerent amb los postulats de Koch (Fig. 1E). E mai se totes los isolats fongics obtenguts èran patogèns e podián infectar la mongeta verda (cv. Giza 3), causant de simptòmas tipics de mòtle blanc sus totas las partidas subre-sòl (Fig. 1F), mai que mai sus las tijas (Fig. 1G) e las pods (Fig. 1H) a 10 jorns après l'inoculacion (Fig. 1H) a 10 jorns après l'inoculacion (3), l'isolat èra mai agressiu doas experiéncias independentas. L'isolat 3 aviá la severitat de malautiá mai nauta (%) sus las plantas de mongeta (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, e 76,7 ± 3,1 a 7, 14 e 21 jorns après l'infeccion, respectivament; Figura 1F).
L'identificacion de l'isolat #3 mai invasiu de S. sclerotiorum foguèt mai confirmada en foncion del sequenciatge de l'espaciador transcrich intèrne (ITS) (Fig. 1I). L'analisi filogenetica entre los isolats #3 e los 20 isolats/socas de referéncia mostrèt una similitud nauta (>99%) entre eles. Es de notar que l'isolat S. sclerotiorum #3 (533 pb) a una nauta similitud amb l'isolat american S. sclerotiorum LPM36 isolat de granas de pèsols secs (numèro d'accès de GenBank MK896659.1; 540 pb) e l'isolat chinés de S. sclerotiorum YK896659.1; 540 pb) e lo nombre d'accès YYK1 OR206374.1; 548 pb), que causa la poiridura de la tija violeta (Matthiola incana), que son totas agropadas separadament al naut del dendrograma (Figura 1I). La novèla sequéncia es estada depausada dins la basa de donadas NCBI e nomenada "Sclerotinia sclerotiorum – isolat YN-25" (numèro d'accession de GenBank PV202792). Se pòt veire que l'isolat 3 es l'isolat mai invasiu; doncas, aquel isolat foguèt causit per l'estudi dins totas las experiéncias seguentas.
L'activitat antibacteriana de la diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) a de concentracions diferentas (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) contra l'isolat 3 de S. sclerotiorum foguèt estudiada in vitro. Es de notar que la L-ornitina exerciguèt un efièch antibacterial e inhibiguèt gradualament la creissença radiala de las ifas de S. sclerotiorum d'un biais dependent de la dòsi (Figura 2A, B). A la concentracion mai nauta testada (125 mg/L), la L-ornitina demostrèt lo taus d'inibicion de la creissença miceliala mai naut (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), qu'èra equivalent al fongicida comercial Rizolex-T (taus d'inibicion 99,45 ± 0,39%; 2C) testat a la concentracion testada (10 mg/L), Figura 2B), a la concentracion testada (10 mg/L). indicant una eficacitat similara.
Figura 2. Activitat antibacteriana in vitro de L-ornitina contra Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparason de l'activitat antibacteriana de diferentas concentracions de L-ornitina contra S. sclerotiorum amb lo fongicida comercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Taus d'inibicion (%) de la creissença miceliala de S. sclerotiorum après tractament amb de concentracions diferentas de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L), respectivament. Las valors representan la mejana ± DS de cinc replicas biologicas (n = 5). De letras diferentas indican de diferéncias estatisticas entre los tractaments (p < 0,05). (D, E) Analisi de regression de modèl Probit de L-ornitina e de fongicida comercial Rizolex-T, respectivament. La linha de regression del modèl probit es mostrada coma una linha blava solida, e l'interval de confiéncia (95%) es mostrada coma una linha roja traçada.
De mai, l'analisi de regression probit foguèt realizada e los grafics correspondents son mostrats dins lo tablèu 1 e las figuras 2D,E. En resumit, la valor de penda acceptabla (y = 2,92x − 4,67) e las estatisticas significativas associadas (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 e p < 0,0001; Figura 2D) de L-ornitina indiquèron una activitat antifongica melhorada contra lo Srocle comercial. fongicida Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 e p < 0,0001) (Taula 1).
Taula 1. Valors de la concentracion inibitòria mièja maximala (IC50) e IC99 (mg/l) de L-ornitina e de fongicida comercial "Rizolex-T" contra S. sclerotiorum.
Globalament, L-ornitina (250 mg/L) redusiguèt significativament lo desvolopament e la severitat del mòtle blanc sus las plantas de mongetas comunas tractadas comparadas a las plantas infectadas per S. sclerotiorum non tractadas (contraròtle; Figura 3A). En resumit, e mai se la severitat de la malautiá de las plantas de contraròtle infectadas non tractadas aumentèt gradualament (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, e 92,33 ± 3,06%), la L-ornitina redusiguèt significativament la severitat de la malautiá (%) al cors de l'experiéncia (8,97 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, e 92,33 ± 3,06%), la L-ornitina redusiguèt significativament la severitat de la malautiá (%) pendent tot l'experiéncia (8,97 ± 1,15, 1,00 ± 1,00, e 1,00 ± 1,00, e 1,00, e 1,00 ± 1,00). 26,36 ± 3,07) a 7, 14, e 21 jorns après tractament (dpt), respectivament (Figura 3A). De manièra similara, quand las plantas de mongetas infectadas per S. sclerotiorum foguèron tractadas amb 250 mg/L de L-ornitina, l'airal jos la corba de progression de la malautiá (AUDPC) diminuiguèt de 1274,33 ± 33,13 dins lo contraròtle non tractat a 281,03 ± 7,95, çò qu'èra leugièrament mai bas que lo positiu del contraròtle de 50 mg/L. mg/L de fongicida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). La meteissa tendéncia foguèt observada dins lo segond experiment.
Fig. 3. Efièch de l'aplicacion exogèna de L-ornitina sul desvolopament de la poiridura blanca de la mongeta comuna causada per Sclerotinia sclerotiorum dins de condicions de sèrra. (A) Corba de progression de la malautiá del mòtle blanc de mongeta comuna après tractament amb 250 mg/L de L-ornitina. (B) Airal jos la corba de progression de la malautiá (AUDPC) de mòtle blanc de mongeta comuna après tractament amb L-ornitina. Las valors representan la mejana ± DS de cinc replicas biologicas (n = 5). De letras diferentas indican de diferéncias estatisticament significativas entre los tractaments (p < 0,05).
L'aplicacion exogèna de 250 mg/L de L-ornitina aumentèt gradualament la nautor de la planta (Fig. 4A), lo nombre de brancas per planta (Fig. 4B), e lo nombre de fuèlhas per planta (Fig. 4C) après 42 jorns. Alara que lo fongicida comercial Rizolex-T (50 mg/L) aguèt l'efièch mai grand sus totes los paramètres nutricionals estudiats, l'aplicacion exogèna de 250 mg/L L-ornitina aguèt lo segond efièch mai grand comparat als contraròtles non tractats (Figs. 4A–C). D'un autre costat, lo tractament amb L-ornitina aguèt pas cap d'efièch significatiu sul contengut dels pigments fotosintetics clorofila a (Fig. 4D) e clorofila b (Fig. 4E), mas aumentèt leugièrament lo contengut total de carotenoïdes (0,56 ± 0,03 mg/g fr wt) comparat al contraròtle negatiu (0,44 ± 0,03 mg/g p. contraròtle (0,46 ± 0,02 mg/g fr wt; Fig. 4F). Globalament, aqueles resultats indican que la L-ornitina es pas fitotoxica pels legums tractats e pòt quitament estimular lor creissença.
Fig. 4. Efièch de l'aplicacion exogèna de L-ornitina sus las caracteristicas de creissença e los pigments fotosintetics de las fuèlhas de mongeta infectadas amb Sclerotinia sclerotiorum dins de condicions de sèrra. (A) Nautor de la planta (cm), (B) Nombre de brancas per planta, (C) Nombre de fuèlhas per planta, (D) Contengut de clorofila a (mg g-1 pes), (E) Contengut de clorofila b (mg g-1 pes), (F) Contengut total de carotenoïdes (mg g-1 pes). Las valors son la mejana ± ED de cinc replicas biologicas (n = 5). De letras diferentas indican de diferéncias estatisticament significativas entre los tractaments (p < 0,05).
La localizacion istoquimica in situ d'espècias d'oxigèn reactiu (ROS; exprimits coma peroxid d'idrogèn [H2O2]) e de radicals liures (exprimits coma anions superoxids [O2•−]) revelèt que l'aplicacion exogèna de L-ornitina (250 mg/L) redusiguèt significativament l'acumulacion de H2O2 (205 ± nmol.g−1 FW; Fig. 5A) e O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) comparat a l'acumulacion de las doas plantas infectadas non tractadas (173,31 ± 12,06 e 149,35 ± 7,94 nl.g−1 FW, respectivament) amb planta tractada mg/L del fongicida comercial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 e 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respectivament) a 72 h. De nivèls nauts de H2O2 e O2•− s'acumulavan jos hpt (Fig. 5A, B). De manièra similara, l'assaig de malondialdeïd (MDA) basat sus TCA mostrèt que las plantas de mongetas infectadas per S. sclerotiorum acumulavan de nivèls mai nauts de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) dins lors fuèlhas (Fig. 5C). Pasmens, l'aplicacion exogèna de L-ornitina redusiguèt significativament la peroxidacion lipida coma o mòstra la diminucion del contengut de MDA dins las plantas tractadas (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Efièch de l'aplicacion exogèna de L-ornitina sus de marcadors màgers d'estrès oxidatiu e de mecanismes de defensa antioxidant non enzimatics dins de fuèlhas de mongeta infectadas amb S. sclerotiorum a 72 oras après l'infeccion dins de condicions de sèrra. (A) Peroxid d'idrogèn (H2O2; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (B) anion de superoxid (O2•−; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (C) malondialdehid (MDA; nmol g−1 FW) a 72 hpt, (D) fenòls solubles totals (G−1 g−FW) a 72 hpt hpt, (E) flavonoïdes solubles totals (mg RE g−1 FW) a 72 hpt, (F) aminoacids liures totals (mg g−1 FW) a 72 hpt, e (G) contengut de prolina (mg g−1 FW) a 72 hpt. Las valors representan la mejana ± desviacion estandard (mejana ± ED) de 5 replicas biologicas (n = 5). De letras diferentas indican de diferéncias estatisticament significativas entre los tractaments (p < 0,05).