Present *Adreça actuala: Colònia 50931, Alemanha, Recèrca de Cluster d'Excelléncia de Colònia sus la Responsa a l'estrès cellular dins las malautiás ligadas a l'envielhiment (CECAD).
La neurodegeneracion de las malautiás mitocondrialas es considerada irreversibla perque la plasticitat metabolica de las neurònas es limitada, mas l'efièch de la disfoncion mitocondriala sus l'autonomia cellulara del metabolisme neuronal dins lo còrs es mal comprés. Aquí, introdusèm lo proteòma especific a la cellula de las neurònas de Purkinje amb una deficiéncia progressiva d'OXPHOS causada per una dinamica de fusion mitocondriala perturbada. Trobèrem que la disfoncion mitocondriala desencadenèt un cambiament prigond dins lo domeni de la proteomica, çò que menèt finalament a l'activacion sequenciala de programas metabolics precises abans la mòrt cellulara. De manièra inesperada, determinèrem l'induccion evidenta de la piruvat carboxilasa (PCx) e d'autres enzims anti-vielhiment que complementan los intermediaris del cicle TCA. L'inibicion de PCx exacerbèt l'estrès oxidatiu e la neurodegeneracion, çò qu'indica que l'ateroscleròsi a un efièch protector dins las neurònas sens OXPHOS. La restauracion de la fusion mitocondriala dins de neurònas terminalament degeneradas invèrsa completament aquelas caracteristicas metabolicas, empachant aital la mòrt cellulara. Nòstras descobèrtas identifican de vias desconegudas abans que conferisson de resiliéncia a la disfoncion mitocondriala e mòstran que la neurodegeneracion pòt èsser inversada quitament dins las estapas tardièras de la malautiá.
Lo ròtle central de las mitocondrias dins lo mantenement del metabolisme de l'energia neuronala es soslinhat pels simptòmas neurologics extensius associats a las malautiás mitocondrialas umanas. La màger part d'aquelas malautiás son causadas per de mutacions genicas que regulan l'expression genica mitocondriala (1, 2) o la destruccion genica ligada a la dinamica mitocondriala, qu'afèctan indirèctament l'estabilitat de l'ADN mitocondrial (mtDNA) (3, 4). Lo trabalh sus de modèls animals a mostrat qu'en responsa a la disfoncion mitocondriala dins los teissuts environants, de vias metabolicas conservatriças (5-7) pòdon èsser activadas, çò que provesís d'informacions importantas per una compreneson prigonda de la patogenèsi d'aquelas malautiás complèxas. En contraste fòrt, nòstra compreneson dels cambiaments metabolics de tipes de cellulas especifics causats per l'insuccès general de la produccion d'adenosina trifosfat (ATP) mitocondrial cerebral es fondamentala (8), en soslinhant la necessitat d'identificar de ciblas terapeuticas que pòdon èsser utilizadas per prevenir o prevenir la malautiá. Prevenir la neurodegeneracion (9). La manca d'informacion es lo fach que las cellulas nerviosas son largament consideradas coma una flexibilitat metabolica fòrça limitada comparada als tipes de cellulas dels teissuts environants (10). Coma aquelas cellulas jògan un ròtle central dins la coordinacion de l'avitalhament de metabolits a las neurònas per promòure la transmission sinaptica e respondre a las condicions de lesion e de malautiá, la capacitat d'adaptar lo metabolisme cellular a las condicions dificilas del teissut cerebral es gaireben limitada a las cellulas glialas (11-14). De mai, l'eterogeneïtat cellulara inerenta del teissut cerebral empacha largament l'estudi dels cambiaments metabolics que se produson dins de sosgrops neuronals especifics. En consequéncia, se sap pauc sus las consequéncias cellularas e metabolicas exactas de la disfoncion mitocondriala dins las neurònas.
Per comprene las consequéncias metabolicas de la disfoncion mitocondriala, isolèrem de neurònas de Purkinje (PNs) dins diferents estadis de neurodegeneracion causadas per la destruccion de la fusion de la membrana exteriora mitocondriala (Mfn2). E mai se las mutacions de Mfn2 dins los umans son associadas a una forma de neuropatia sensoriala motora ereditària coneguda coma Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), la destruccion condicionala de Mfn2 dins de mirgas es un metòde de disfoncion d'induccion d'oxidacion de fosforilacion (OXPHOS) plan reconegut. Los divèrses sostipes neuronals (16-19) e lo fenotipe neurodegeneratiu resultant son acompanhats de simptòmas neurologics progressius, coma de desòrdres del movement (18, 19) o d'ataxia cerebellara (16). En utilizant una combinason de proteomica quantitativa sens etiqueta (LFQ), metabolomica, imatgeria, e metòdes virologics, mostram que la neurodegeneracion progressiva indusís fòrtament la piruvat carboxilasa (PCx) e d'autres factors implicats dins l'arterioscleròsi dels PNs in vivo L'expression dels enzims. Per verificar la pertinéncia d'aquela descobèrta, avèm especificament rebaissat l'expression de PCx dins de PNs deficients en Mfn2, e trobèrem qu'aquela operacion agravava l'estrès oxidatiu e accelerava la neurodegeneracion, provant aital que l'azoospermia conferís la mòrt cellulara L'adaptabilitat metabolica. L'expression sevèra de MFN2 pòt completament salvar la degeneracion terminala PN amb una deficiéncia grèva d'OXPHOS, una consomacion massiva d'ADN mitocondrial, e un ret mitocondrial aparentament trencat, çò que soslinha mai qu'aquela forma de neurodegeneracion pòt quitament se recuperar dins l'estadi avançat de la malautiá abans la mòrt cellulara.
Per visualizar las mitocondrias dins los PNs knockout Mfn2, utilizèrem una soca de mirga que permet a las mitocondrias dependentas de Cre de ciblar l'expression de la proteïna fluorescenta jauna (YFP) (mtYFP) (20) e verificam la morfologia mitocondriala in vivo. Trobèrem que la destruccion del gèn Mfn2 dins los PNs menariá a la division graduala de la ret mitocondriala (Figura S1A), e lo cambiament mai primièr foguèt trobat a 3 setmanas d'edat. En contraste, la degeneracion substanciala de la capa cellulara PN, coma o mòstra la pèrda de l'immunocoloracion de Calbindin, comencèt pas fins a 12 setmanas d'edat (Figura 1, A e B). Lo desacòrdi de temps entre los primièrs cambiaments de la morfologia mitocondriala e l'aparicion visibla de la mòrt neuronala nos incitèt a estudiar los cambiaments metabolics desencadenats per la disfoncion mitocondriala abans la mòrt cellulara. Desvolopèrem una estrategia basada sus de classament de cellulas activadas per fluorescéncia (FACS) per isolar PN exprimissent YFP (YFP+) (Figura 1C), e dins de mirgas de contraròtle (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), nomenadas aquí CTRL (Figura S1B). L'optimizacion de l'estrategia de portada basada sus l'intensitat relativa del senhal YFP nos permet de purificar lo còrs YFP+ (YFPhigh) de PNs de non-PNs (YFPneg) (Figura S1B) o de fragments putatius d'axon/dendritic fluorescents (YFPlow; Figura S1D, esquèrra), confirmats per un microscòpi confocal (Figura S1D, drecha). Per verificar l'identitat de la populacion classada, menèrem la proteomica LFQ e puèi una analisi de compausants principals, e trobèrem qu'i a una separacion clara entre las cellulas YFPhigh e YFPneg (Figura S1C). Las cellulas YFPhigh mostrèron un enriquiment net de marcaires PNs coneguts (es a dire Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), mas pas cap d'enriquiment de proteïnas comunament exprimidas dins de neurònas o d'autres tipes de cellulas (Figura 1D) ). Una comparason entre de mòstras dins de cellulas YFPhigh classadas collectadas dins d'experiéncias independentas mostrèt un coeficient de correlacion> 0,9, demostrant una bona reproductibilitat entre de replicas biologicas (Figura S1E). En resumit, aquelas donadas validèron nòstre plan per l'isolament agut e especific de PN factible. Perque lo sistèma de pilòt L7-cre utilizat indusís la recombinacion de mosaïca dins la primièra setmana après lo part (23), comencèrem de tuar de mirgas de CTRL e condicional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Collectar de neurònas. Après que la recombinacion es completada, es nomenada Mfn2cKO a 4 setmanas d'edat. Coma punt final, causiguèrem 8 setmanas d'edat quand la capa PN èra intacta malgrat la fragmentacion mitocondriala evidenta (Figura 1B e Figura S1A). En total, quantifiquèrem un total de 3013 proteïnas, que aperaquí 22% èran basadas sus d'anotacions de MitoCarta 2.0 basadas sul proteòma mitocondrial coma mitocondrias (Figura 1E) (Figura 1E) (24). L'analisi d'expression genica diferenciala realizada a la setmana 8 mostrèt que sonque 10,5% de totas las proteïnas avián de cambiaments significatius (Figura 1F e Figura S1F), que 195 proteïnas èran en bas-reguladas e 120 proteïnas èran en naut-reguladas (Figura 1F). Es de notar que l'"analisi de vias innovatritz" d'aqueste ensemble de donadas mòstra que los gèns exprimits diferencialament apartenon subretot a un ensemble restrench de vias metabolicas especificas (Figura 1G). Curiosament, e mai se la desregulacion de las vias ligadas a l'OXPHOS e a la senhalacion de calci confirma l'induccion de la disfoncion mitocondriala dins los PNs deficients en fusion, d'autras categorias qu'implican subretot lo metabolisme d'aminoacids son significativament susreguladas, çò qu'es en linha amb lo metabolisme que se produtz dins los PNs mitocondrials. disfoncion.
(A) Fotografias confocalas representativas de seccions cerebellaras de mirgas CTRL e Mfn2cKO mostrant una pèrda progressiva de PNs (calbindin, gris); los nuclèus foguèron contracolorats amb DAPI. (B) Quantificacion de (A) (analisi unidireccionala de variança, ***P<0,001; n = 4 a 6 cercles de tres mirgas). (C) Flux de trabalh experimental. (D) Distribucion de mapa de calor de marcadors especifics a Purkinje (naut) e d'autres tipes de cellulas (mièg). (E) Diagrama de Venn mostrant lo nombre de proteïnas mitocondrialas identificadas dins lo PN classat. (F) Grafic volcan de proteïnas exprimidas diferencialament dins de neurònas Mfn2cKO a 8 setmanas (valor de talh de significacion de 1,3). (G) L'analisi de la via de creativitat mòstra las cinc vias de regulacion ascendenta (roge) e de regulacion bassa (blau) mai importantas dins lo PN Mfn2cKO classat coma 8 setmanas. Lo nivèl d'expression mejan de cada proteïna detectada es mostrat. Mapa de calor a escala de grises: valor P ajustada. ns, pas important.
Las donadas proteomicas mostrèron que l'expression proteïca dels complèxes I, III e IV diminuiguèt gradualament. Los complèxes I, III e IV contenián totes de sosunitats essencialas codificadas per mtDNA, del temps que lo complèxe II, qu'èra sonque codificat nuclear, èra basicament pas afectat (Figura 2A e Figura S2A). . Coerent amb los resultats proteomics, l'immunoistoquimia de las seccions de teissut cerebellar mostrèt que lo nivèl de sosunitat MTCO1 (sosunitat 1 de citocròm C oxidasa mitocondriala) del complèxe IV dins PN diminuiguèt gradualament (Figura 2B). La sosunitat Mtatp8 codada per mtDNA foguèt significativament redusida (Figura S2A), del temps que lo nivèl d'estat estacionari de la sosunitat ATP sintasa codada nucleara demorèt inchangé, çò qu'es coerent amb lo complèxe F1 de sos-assemblatge ATP sintasa estable conegut quand l'expression mtDNA es establa. La formacion es coerenta. Interrompre (7). L'avaloracion del nivèl d'ADNmt dins los PNs Mfn2cKO triats per reaccion en cadena de polimerasa en temps real (qPCR) confirmèt la diminucion graduala del nombre de còpias d'ADNmt. Comparat amb lo grop de contraròtle, a 8 setmanas d'edat, sonque aperaquí 20% del nivèl d'ADNmt foguèt retengut (Figura 2C). Coerent amb aqueles resultats, la coloracion de microscopia confocala de PNs Mfn2cKO foguèt utilizada per detectar l'ADN, mostrant la consomacion dependenta del temps de nucleotids mitocondrials (Figura 2D). Trobèrem que sonque qualques candidats implicats dins la degradacion de las proteïnas mitocondrialas e la responsa a l'estrès èran regulats en naut, dont Lonp1, Afg3l2 e Clpx, e los factors d'assemblatge del complèxe OXPHOS. Cap de cambiament significatiu dins los nivèls de proteïnas implicadas dins l'apoptosi foguèron pas detectats (Figura S2B). De manièra similara, trobèrem que las mitocondrias e los canals del reticul endoplasmic implicats dins lo transpòrt de calci an pas que de cambiaments menors (Figura S2C). De mai, l'avaloracion de las proteïnas ligadas a l'autofagia trobèt pas de cambiaments significatius, çò qu'es coerent amb l'induccion visibla d'autofagosòmas observada in vivo per immunoistoquimia e microscopia electronica (Figura S3). Pasmens, la disfoncion progressiva d'OXPHOS dins los PNs es acompanhada de cambiaments mitocondrials ultrastructurals evidents. De clusters mitocondrials pòdon èsser vists dins los còrs cellulars e los arbres dendritics dels PNs Mfn2cKO d'edat de 5 e 8 setmanas, e l'estructura de la membrana intèrna a subit de cambiaments prigonds (Figura S4, A e B). Coerent amb aqueles cambiaments ultraestructurals e una diminucion significativa de l'ADNm, l'analisi de tranchas cerebralas agudas amb d'èster metil de tetrametilrodamina (TMRM) mostrèt que lo potencial de la membrana mitocondriala dins los PNs Mfn2cKO èra significativament diminuit (Figura S4C).
(A) Analisi del cors del temps del nivèl d'expression del complèxe OXPHOS. Consideratz pas que las proteïnas amb P<0,05 a 8 setmanas (ANOVA bidireccionala). Linha ponctuada : Pas d'ajustament comparat a CTRL. (B) Esquèrra: Un exemple d'una seccion cerebellara marcada amb d'anticòrs anti-MTCO1 (barra d'escala, 20 μm). L'airal ocupat pels còrs cellulars de Purkinje es cobèrt de jaune. Drecha: Quantificacion dels nivèls de MTCO1 (analisi unidireccionala de la variacion; n = 7 a 20 cellulas analizadas a partir de tres mirgas). (C) Analisi qPCR del nombre de còpias d'ADNmt dins lo PN triat (analisi unidireccional de variança; n = 3 a 7 mirgas). (D) Esquèrra: Un exemple d'una trancha cerebellara marcada amb un anticòrs anti-ADN (barra d'escala, 20 μm). L'airal ocupat pels còrs cellulars de Purkinje es cobèrt de jaune. Drecha: Quantificacion de las lesions d'ADNmt (analisi unidireccionala de la variança; n = 5 a 9 cellulas de tres mirgas). (E) Un exemple d'una seccion cerebellara aguda mostrant de cellulas mitoYFP + Purkinje (flècha) dins un enregistrament de pinça de parche de cellula entièra. (F) Quantificacion de la corba IV. (G) Enregistraments representatius d'injeccion de corrent despolarizant dins de cellulas CTRL e Mfn2cKO de Purkinje. Traça superiora: Lo primièr pols que desencadenèt l'AP. Traça inferiora: Frequéncia AP maximala. (H) Quantificacion de las entradas espontanèas postsinapticas (sPSPs). La traça d'enregistrament representativa e son rapòrt de zoom son mostrats dins (I). L'analisi unidireccionala de la variança analizèt n = 5 a 20 cellulas de tres mirgas. Las donadas son exprimidas coma mejana±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Traças representativas d'AP espontanèa enregistradas en utilizant lo mòde de pinça de parche perforat. Traça superiora: Frequéncia AP maximala. Traça de bas: zoom d'un sol AP. (K) Quantificar la frequéncia AP mejana e maximala segon (J). tèst de Mann-Whitney; n = 5 cellulas foguèron analizadas a partir de quatre mirgas. Las donadas son exprimidas coma mejana±SEM; pas important.
Un damatge evident d'OXPHOS foguèt detectat dins lo PN Mfn2cKO de 8 setmanas, çò qu'indica que la foncion fisiologica de las neurònas es grèvament anormala. Doncas, analizèrem las caracteristicas electricas passivas de las neurònas deficientas en OXPHOS a 4 a 5 setmanas e 7 a 8 setmanas en realizant d'enregistraments de pinça de parche de cellula entièra dins de tranchas cerebellaras agudas (Figura 2E). Inesperadament, lo potencial mejan de la membrana de repaus e la resisténcia d'entrada de las neurònas Mfn2cKO èran similars al contraròtle, e mai se i aviá de diferéncias subtilas entre las cellulas (Taula 1). De manièra similara, a 4 a 5 setmanas d'edat, cap de cambiament significatiu dins la relacion corrent-tension (corba IV) foguèt pas trobat (Figura 2F). Pasmens, cap de neuròna Mfn2cKO de 7 a 8 setmanas subrevisquèt al regim IV (etapa d'iperpolarizacion), çò qu'indica qu'i a una sensibilitat clara al potencial d'iperpolarizacion a aquel estadi tardièr. En contraste, dins las neurònas Mfn2cKO, los corrents despolarizants que causan de descargas de potencial d'accion repetitiu (AP) son plan tolerats, çò qu'indica que lors modèls de descarga globals son pas significativament diferents d'aqueles de las neurònas de contraròtle de 8 setmanas (Taula 1 e Figura 2G). De manièra similara, la frequéncia e l'amplitud dels corrents postsinaptics espontanèus (sPSCs) èran comparables a aqueles del grop de contraròtle, e la frequéncia dels eveniments aumentèt de 4 setmanas a 5 setmanas a 7 setmanas a 8 setmanas amb un aument similar (Figura 2, H e I). Lo periòde de maduracion sinaptica dins los PN (25). De resultats similars foguèron obtenguts après de parches de PNs traucats. Aquesta configuracion empacha la possibla compensacion dels defauts ATP cellulars, coma poiriá arribar dins l'enregistrament de pinça de parche de cellula entièra. En particular, lo potencial de la membrana de repaus e la frequéncia de tir espontanèu de las neurònas Mfn2cKO foguèron pas afectats (Figura 2, J e K). En resumit, aqueles resultats indican que los PN amb una disfoncion evidenta d'OXPHOS pòdon plan far fàcia als modèls de descarga de nauta frequéncia, çò qu'indica qu'existís un mecanisme de compensacion que lor permet de manténer de responsas electrofisiologicas gaireben normalas.
Las donadas son exprimidas coma mejana ± SEM (analisi unidireccionala de la variança, tèst de comparason multipla de Holm-Sidak; *P<0,05). Lo numèro d'unitat es indicat entre parentèsis.
Nos metèrem a estudiar se quina categoria que siá dins l'ensemble de donadas de proteomica (Figura 1G) inclutz de vias que pòdon contrarotlar una deficiéncia grèva d'OXPHOS, explicant aital perqué PN afectat pòt manténer una electrofisiologia gaireben normala (Figura 2, E a K). . L'analisi proteomica mostrèt que los enzims implicats dins lo catabolisme dels aminoacids de cadena ramificada (BCAA) èran significativament regulats en naut (Figura 3A e Figura S5A), e lo produch final acetil-CoA (CoA) o succinil CoA pòt complementar los tricarboxilats dins lo cicle de l'acid arterioscleròsi (TCA). Trobèrem que lo contengut de transaminasa 1 BCAA (BCAT1) e BCAT2 aumentèron. Catalizan la primièra etapa del catabolisme BCAA en generant de glutamat a partir d'α-cetoglutarat (26). Totas las sosunitats que compausan lo complèxe de la cadena ramificada cetoacid deshidrogenasa (BCKD) son reguladas en naut (lo complèxe cataliza la descarboxilacion seguenta e irreversibla de l'esqueleta de carbòni BCAA resultant) (Figura 3A e Figura S5A). Pasmens, cap de cambiament evident dins lo quite BCAA foguèt pas trobat dins lo PN triat, çò que pòt èsser degut a l'aumentacion de l'absorpcion cellulara d'aqueles aminoacids essencials o a l'utilizacion d'autras fonts (glucòsa o acid lactic) per complementar lo cicle TCA (Figura S5B). Los PNs mancant d'OXPHOS mostrèron tanben una activitat de descomposicion e de transaminacion de glutamina aumentada a 8 setmanas d'edat, çò que pòt èsser reflectit per la regulacion ascendenta dels enzims mitocondrials glutaminasa (GLS) e glutamina piruvat transaminasa 2 (GPT2) (Figura 3, A e C). Es de notar que la regulacion ascendenta de GLS es limitada a l'isoforma glutaminasa C empalmada (GLS-GAC) (lo cambiament de Mfn2cKO/CTRL es aperaquí 4,5 còps, P = 0,05), e sa regulacion ascendenta especifica dins los teissuts cancerós Pòt sostenir la bioenergia mitocondriala. (27).
(A) La mapa de calor mòstra lo cambiament de plec del nivèl de proteïna per la rota especificada a 8 setmanas. (B) Exemple d'una trancha cerebellara marcada amb d'anticòrs anti-PCx (barra d'escala, 20 μm). La sageta jauna punta cap al còrs de la cellula de Purkinje. (C) Analisi d'expression de proteïna del cors del temps identificada coma un candidat important per l'ateroscleròsi (t-test multiple, *FDR <5%; n = 3-5 mirgas). (D) Dessús: Un diagrama esquematic que mòstra las diferentas manièras d'intrar dins lo carbòni marcat contengut dins lo traçaire [1-13C]piruvat (es a dire, via PDH o via transarteriala). En bas: Lo tablèu de violon mòstra lo percentatge de carbòni monomarcat (M1) convertit en acid aspartic, acid citric e acid malic après aver etiquetat de tranchas cerebellaras agudas amb [1-13C]piruvat (t-test acoblat; ** P <0,01). (E) Analisi completa de l'istòria del temps del camin indicat. Consideratz pas que las proteïnas amb P<0,05 a 8 setmanas. Linha traçada: pas de valor d'ajustament (analisi bidireccionala de variança; * P <0,05; *** P <0,001). Las donadas son exprimidas coma mejana±SEM.
Dins nòstra analisi, lo catabolisme BCAA es vengut una de las vias claus de regulacion en naut. Aqueste fach suggerís fòrtament que lo volum de ventilacion dintrant dins lo cicle TCA pòt èsser cambiat dins PN mancant d'OXPHOS. Aquò pòt representar una forma màger de recablament metabolic neuronal, que pòt aver un impacte dirècte sus la fisiologia neuronala e la subrevida pendent lo mantenement d'una disfoncion grèva d'OXPHOS. Coerent amb aquesta ipotèsi, trobèrem que l'enzim antiaterosclerotic principal PCx es regulat en naut (Mfn2cKO/CTRL càmbia aperaquí 1,5 còps; Figura 3A), çò que cataliza la conversion del piruvat en oxaloacetat (28), que se crei qu'es dins los teissuts cerebrals l'expression d'astrocits es restrench (29, 30). Coerent amb los resultats de proteòmica, la microscopia confocala mostrèt que l'expression de PCx èra especificament e significativament aumentada dins los PNs deficients en OXPHOS, del temps que la reactivitat de PCx èra subretot restrencha a las cellulas glialas Bergmann adjacentas del contraròtle (Figura 3B). Per testar foncionalament la regulacion en naut observada de PCx, tractèrem de tranchas cerebellàrias agudas amb un traçaire [1-13C]piruvat. Quand lo piruvat foguèt oxidat per la piruvat desidrogenasa (PDH), son etiqueta d'isotòp desapareguèt , Mas es incorporat dins los intermediaris del cicle TCA quand lo piruvat es metabolizat per de reaccions vascularas (Figura 3D). En sosten de nòstras donadas proteomicas, observèrem un grand nombre de marcaires d'aqueste traçaire dins l'acid aspartic de las tranchas Mfn2cKO, del temps que l'acid citric e l'acid malic avián tanben una tendéncia moderada, e mai se pas significativa (Figura 3D).
Dins las neurònas de dopamina de las mirgas MitoPark amb una disfoncion mitocondriala causada per de neurònas de dopamina que destruson especificament lo gèn del factor de transcripcion mitocondriala A (Tfam) (Figura S6B), l'expression de PCx èra tanben significativament regulada en naut (31), çò qu'indica que l'aparicion de l'acid d'acetona L'aparicion de la malautiá es regulada pendent la disfoncion neuronala OXFOS dins lo còrs. Es de notar qu'es estat trobat que d'enzims unics (32-34) que pòdon èsser exprimits dins de neurònas que pòdon èsser associadas a l'arterioscleròsi son significativament regulats en naut dins los PNs mancants d'OXPHOS, coma la carboxilasa de propionil-CoA (PCC-A), lo malonil-CoA convertís lo propionil-CoA en mitocolinil e la mitocondrial malinica enzima 3 (ME3), que son ròtle principal es de recuperar lo piruvat del malat (Figura 3, A e C) (33, 35). De mai, trobèrem un aument significatiu de l'enzim Pdk3, que fosforila e aital inactiva PDH (36), del temps que cap de cambiament foguèt pas detectat dins l'enzim Pdp1 qu'activa PDH o lo complèxe enzimatic PDH meteis (Figura 3A). De manièra coerenta, dins los PNs Mern2cKO, la fosforilacion de la sosunitat α1 α (PDHE1α) del compausant de piruvat desidrogenasa E1 del complèxe PDH dins Ser293 (conegut per inhibir l'activitat enzimatica de PDH) foguèt melhorada ( Figura S6C) (Figura S6C). Lo piruvat a pas d'accès vascular.
Fin finala, trobèrem que la super via de la biosintèsi de serina e de glicina, lo cicle de folat mitocondrial (1C) ligat e la biosintèsi de prolina (Figura 1G e Figura S5C) son totes significativament regulats en naut, segon los rapòrts, pendent lo procès d'activacion. Los teissuts environants son activats amb una disfoncion mitocondriala (5-7). L'analisi confocala que sosten aquelas donadas proteomicas mostrèt qu'en PN amb OXPHOS mancant, de tranchas cerebellaras de mirgas de 8 setmanas foguèron somesas a la serina idroximetiltransferasa 2 (SHMT2), una enzima clau del cicle del folat mitocondrial. Responsa immunitària significativa (Figura S5D). Dins 13 tranchas cerebellàrias agudas incubadas amb CU-glucòsa, d'experiéncias de traçatge metabolic confirmèron mai la regulacion ascendenta de la biosintèsi de serina e prolina, çò qu'indica que lo flux d'isoformas de carbòni dins serina e prolina aumentèt (Figura S5E). Coma las reaccions promogudas per GLS e GPT2 son responsablas de la sintèsi de glutamat a partir de la glutamina e de la transaminacion entre glutamat e α-cetoglutarat, lor regulacion en naut indica que las neurònas deficientas en OXPHOS an una demanda aumentada de glutamat , Aquò pòt èsser destinat a manténer la biosintèsi aumentada de proline (Figura S5). En contraste amb aqueles cambiaments, una analisi proteomica d'astrocits cerebellars de mirgas Mfn2cKO especificas a PN mostrèt qu'aquelas vias (inclusent totas las antiperoxidasas) cambièron pas de manièra significativa en expression, demostrant aital Aquesta redireccion metabolica es selectiva cap a PN degradat (Fig. S6, D a G).
En resumit, aquelas analisis revelèron de modèls significativament diferents d'activacion temporala de vias metabolicas especificas dins los PN. E mai se la foncion mitocondriala neuronala anormala pòt menar a una ateroscleròsi precoça e a un remodelament 1C (Figura 3E e Figura S5C), e quitament de cambiaments previsibles dins l'expression dels complèxes I e IV, los cambiaments dins la sintèsi de serina de novo son pas que venguèt evident sonque dins las estapas tardièras. Disfoncion OXPHOS (Figura 3E e Figura S5C). Aquestas descobèrtas definisson un procès sequencial que la responsa mitocondriala (cicle 1C) e citoplasmatica (biosintèsi de serina) inducha per l'estrès respondon sinergicament amb l'aument de l'ateroscleròsi dins lo cicle TCA per remodelar lo metabolisme neuronal.
Los PNs deficients en OXPHOS de 8 setmanas pòdon manténer una activitat d'excitacion a nauta frequéncia e subir una reconexion metabolica significativa per compensar la disfoncion mitocondriala. Aquesta descobèrta pausa una possibilitat interessanta que quitament a aqueste moment, aquelas cellulas pòdon tanben recebre una intervencion terapeutica per retardar o prevenir la neurodegeneracion. Tard. Avèm resolgut aquela possibilitat a travèrs doas intervencions independentas. Dins lo primièr metòde, concebèrem un vector de virus adeno-associat (AAV) dependent de Cre per que MFN2 pòsca èsser exprimit selectivament dins de PNs deficients en OXPHOS in vivo (Figura S7A). L'AAV codificant MFN2 e lo gèn reportaire fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) foguèron verificats dins de culturas de neurònas primarias in vitro, çò que provoquèt que MFN2 s'exprimiguèsse d'un biais dependent de Cre e rescatèt la morfologia mitocondriala, empachant aital la neuromutacion dins las neurònas Mfn2cKO ( Figura S7, B, B e D). Aprèp, menèrem d'experiéncias in vivo per liurar estereotacticament Mfn2-AAV de 8 setmanas al còrtex cerebellar de Mfn2cKO e de mirgas de contraròtle, e analizèrem de mirgas de 12 setmanas (Figura 4A). Los mirgas Mfn2cKO tractats moriguèron (Figura 1, A e B) (16). La transduccion virala in vivo resultèt en una expression selectiva de PN dins qualques cercles cerebellars (Figura S7, G e H). L'injeccion de l'AAV de contraròtle exprimissent sonque mCherry (Ctrl-AAV) aguèt pas cap d'efièch significatiu sul gra de neurodegeneracion dins los animals Mfn2cKO. En contraste, l'analisi de Mfn2cKOs transdusits ​​amb Mfn2-AAV mostrèt un efièch protector significatiu de la capa cellulara PN (Figura 4, B e C). En particular, la densitat de neurònas sembla èsser gaireben indistinguible dels animals de contraròtle (Figura 4, B e C, e Figura S7, H e I). L'expression de MFN1 mas pas de MFN2 es egalament eficaça per salvar la mòrt neuronala (Figura 4C e Figura S7, C e F), çò qu'indica que l'expression de MFN1 ectopic pòt complementar eficaçament la manca de MFN2. Una analisi suplementària al nivèl de PN unic mostrèt que Mfn2-AAV rescatèt largament l'ultrastructura de las mitocondrias, normalizèt los nivèls d'ADNmt, e inversèt l'expression nauta del marcador anti-angiogènesi PCx (Figura 4, C a E). L'inspeccion visuala de las mirgas Mfn2cKO salvadas dins un estat de repaus mostrèt que lor postura e lors simptòmas motors (movement S1 a S3) èran melhorats. En conclusion, aqueles experiments mòstran que la reïntroduccion retardada de MFN2 dins de PNs grèvament deficients en OXPHOS es sufisenta per inversar la consomacion d'ADNmt e induire l'ateroscleròsi, empachant aital la degeneracion dels axons e la mòrt neuronala in vivo.
(A) Un esquèma mostrant lo calendièr experimental per injeccion d'AAV codificant MFN2 quand la via metabolica indicada es activada. (B) Imatges confocals representatius de tranchas cerebellaras de 12 setmanas transdusidas a 8 setmanas dins de mirgas Mfn2cKO e marcadas amb d'anticòrs anti-Calbindin. Drecha: Escalatge de las fibras d'axon. L'escala del zoom axonal es de 450 e 75 μm. (C) Esquèrra: Quantificacion de la densitat de cellulas de Purkinje dins lo bucle de transduccion AAV (AAV+) (analisi unidireccional de variança; n = 3 mirgas). Drecha: analisi de focus d'ADNmt dins PN transduch a la setmana 12 (t-test non aparelhat; n = 6 cellulas de tres mirgas). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografias electronicas de transmission representativas de PNs de seccions cerebellaras Mfn2cKO transdusidas amb los vectors virals indicats. La masca ròsa illustra l'airal ocupat per de dendritas, e lo carrat ponctuat jaune illustra lo zoom provesit a drecha; n representa lo nuclèu. Barra d'escala, 1μm. (E) mòstra un exemple de coloracion PCx dins PN transdusida a 12 setmanas. Barra d'escala, 20μm. OE, subreexpression; FC, cambiament de plec.
Fin finala, investiguèrem l'importància de la subrevida cellulara inducha per la peroxidasa dins los PN qu'an conegut una disfoncion d'OXPHOS. Generèrem mCherry codificant AAV-shRNA (ARN de forca corta) ciblant especificament l'ARNm PCx de mirga (AAV-shPCx), e injectèrem lo virus o son contraròtle remenat (AAV-scr) dins lo cerebèl de mirgas Mfn2cKO. L'injeccion foguèt realizada dins la quatrena setmana d'edat (Figura 5A) per obténer un knockdown eficaç de PCx pendent lo periòde ont l'expression de PCx aumentèt (Figura 3C) e la capa cellulara PN èra encara intacta (Figura 1A). Val la pena de notar que lo tustatge de PCx (Figura S8A) mena a una acceleracion significativa de la mòrt de PN, que se limita a l'anèl infectat (Figura 5, B e C). Per comprene lo mecanisme dels efièches metabolics induches per la regulacion en naut de PCx, estudièrem l'estatut redox dels PNs après lo knockdown de PCx e lo biocaptor optic mediat per AAV Grx1-roGFP2 foguèron exprimits a l'encòp (Figura S8, B a D) per avalorar lo glutatiòn Lo cambiament relatiu del potencial del peptid redox (383). Puèi, realizèrem una microscopia d'imatgeria de vida de fluorescéncia de dos fotons (FLIM) dins de tranchas cerebralas agudas de Mfn2cKO de 7 setmanas o de companhs de pòcha de contraròtle per detectar de cambiaments potencials dins l'estatut redox citoplasmic après aver verificat las condicions FLIM (Figura S8, E a G). L'analisi mostrèt un aument significatiu de l'estat d'oxidacion d'un sol PN Mfn2cKO sens expression de PCx, qu'es diferent de las neurònas de contraròtle o dels PN Mfn2cKO qu'exprimisson pas qu'RNA shramble (Figura 5, D e E). Quand l'expression de PCx èra subreregulada, lo percentatge de PNs Mfn2cKO mostrant un estat fòrça oxidat aumentèt de mai de tres còps (Figura 5E), çò qu'indica que la regulacion en naut de PCx manteniá la capacitat redox de las neurònas degeneradas.
(A) Un esquèma mostrant lo calendièr experimental per injeccion d'AAV codificant shPCx quand la via metabolica indicada es activada. (B) Fotografias confocalas representativas de seccions cerebellaras de 8 setmanas dins de mirgas Mfn2cKO transdusidas e marcadas amb d'anticòrs anticalcineurina a 4 setmanas. Barra d'escala, 450 μm. (C) Quantificacion de la densitat de cellulas de Purkinje dins de bucles transduches per AAV (analisi unidireccional de variança; n = 3 a 4 mirgas). Las donadas son exprimidas coma mejana±SEM; ***P<0,001. (D) L'imatge FLIM representatiu mòstra la durada de vida mejana de PN de 7 setmanas qu'exprimís lo captor redox de glutation Grx1-roGFP2 jos las condicions experimentalas especificadas. Rapòrt LUT (taula de recèrca): interval de temps de subrevida (en picosegondas). Barra d'escala, 25μm. (E) L'istograma mòstra la distribucion de las valors de vida de Grx1-roGFP2 de (D) (n=158 a 368 cellulas dins doas mirgas jos cada condicion). Lo tablèu de tortas al dessús de cada istograma: mòstra lo nombre de cellulas amb de valors de durada de vida significativament mai longas (roja, oxidada) o mai cortas (blava, redusida), que despassan 1 SD de la valor de durada de vida mejana dins CTRL-AAV-scr. (F) Lo modèl prepausat mòstra l'efièch protector de la regulacion superiora del PCx neuronal.
En tot, las donadas que provesèm aicí mòstran que la reexpression de MFN2 pòt completament salvar PN avançat amb una deficiéncia grèva d'OXPHOS, un esgotament grèu de l'ADNmt, e una morfologia extrèmament anormala similara a l'ista, provesissent aital un progrès continu quitament dins de malautiás avançadas. La neurodegeneracion provesís una pròva reversibla de l'estadi abans la mòrt cellulara. Aqueste gra de flexibilitat metabolica es mai soslinhat per la capacitat de las neurònas a induire l'ateroscleròsi (un recablament del cicle TCA), qu'inhibís l'expression de PCx dins los PN sens OXPHOS e melhora la mòrt cellulara, jogant aital un ròtle protector (Figura 5F).
Dins aqueste estudi, provesiguèrem de pròvas que la responsa dels PNs a la disfoncion d'OXPHOS es de convergir gradualament a l'ateroscleròsi del cicle TCA a travèrs la via d'activacion diferenciala activada pels programas metabolics. Confirmèrem l'analisi proteomica amb fòrça metòdes complementaris e revelèrem que quand son contestats per una disfoncion mitocondriala grèva, las neurònas an una forma d'elasticitat metabolica desconeguda abans. Per nòstra suspresa, tot lo procès de recablament marca pas necessàriament l'estat metabolic terminal qu'acompanha la neurodegeneracion gradualament e irreversiblament, mas nòstras donadas suggerís que pòt constituir una neuròna de mantenença quitament dins l'estadi abans la mòrt cellulara Mecanisme de compensacion foncionala. Aquesta descobèrta indica que las neurònas an un gra considerable de plasticitat metabolica dins lo còrs. Aqueste fach pròva que la reïntroduccion posteriora de MFN2 pòt inversar l'expression de marcadors metabolics claus e prevenir la degeneracion de PN. Al contrari, inhibís l'ateroscleròsi e accelera los nèrvis. transsexual.
Una de las descobèrtas mai fascinantas de nòstra recèrca es que los PN sens OXPHOS pòdon modificar lo metabolisme del cicle TCA en regulant d'enzims qu'estimulan especificament l'arterioscleròsi. Lo reorganizament metabolic es una caracteristica comuna de las cellulas cancerosas, que qualques unas s'apièjan sus la glutamina per complementar los intermediaris del cicle TCA per produire d'equivalents reductors, que menan la cadena respiratòria e mantenon la produccion de precursors de biosintèsi de lipids e de nucleotids (39 , 40). Un estudi recent mostrèt que dins los teissuts periferics qu'experimentan una disfoncion OXPHOS, la reconnexion del metabolisme glutamina/glutamat es tanben una caracteristica proeminenta (5, 41), ont la direccion de l'intrada de glutamina dins lo cicle TCA depend de A causa de la severitat de la lesion OXPHOS (41). ). Pasmens, i a una manca d'evidéncia clara sus quina similitud que siá de la plasticitat metabolica neuronala dins lo còrs e sa possibla pertinéncia dins lo contèxte de la malautiá. Dins un estudi in vitro recent, se mostrèt que las neurònas corticalas primàrias mobilizan de pòls de glutamat per la neurotransmission, promòvent aital lo metabolisme oxidatiu e l'ateroscleròsi jos de condicions d'estrès metabolic (42). Es de notar que jos l'inibicion farmacologica de l'enzim del cicle TCA succinat desidrogenasa, se crei que la carboxilacion de piruvat manten la sintèsi de l'oxaloacetat dins de neurònas de granul cerebellar cultivats (34). Pasmens, la pertinéncia fisiologica d'aqueles mecanismes pel teissut cerebral (ont se crei que l'ateroscleròsi es subretot confinada als astrocits) a encara una significacion fisiologica importanta (43). Dins aquel cas, nòstras donadas mòstran que los PNs damatjats per OXPHOS dins lo còrs pòdon èsser cambiats a la degradacion BCAA e a la carboxilacion de piruvat, que son las doas fonts principalas de suplementacion d'intermediaris del pool TCA. E mai se la contribucion putativa del catabolisme BCAA al metabolisme de l'energia neuronala es estada prepausada, en mai del ròtle del glutamat e del GABA per la neurotransmission (44), i a pas encara cap de pròva per aqueles mecanismes in vivo. Es doncas aisit d'especular que los PN disfoncionals pòdon automaticament compensar la consomacion d'intermediaris TCA menats pel procès d'assimilacion en aumentant l'ateroscleròsi. En particular, la regulacion superiora de PCx pòt èsser necessària per manténer una demanda aumentada d'acid aspartic, çò que se suggerís dins de cellulas en proliferacion amb disfoncion mitocondriala (45). Pasmens, nòstra analisi metabolomica revelèt pas cap de cambiament significatiu dins lo nivèl d'estat estacionari de l'acid aspartic dins los PNs Mfn2cKO (Figura S6A), çò que reflècha probablament l'utilizacion metabolica diferenta de l'acid aspartic entre las cellulas en proliferacion e las neurònas post-mitoticas. E mai se lo mecanisme exacte de la regulacion superiora de PCx dins de neurònas disfoncionalas in vivo demòra de caracterizar, demostrèrem qu'aquela responsa prematura jòga un ròtle important per manténer l'estat redox de las neurònas, çò que foguèt demostrat dins d'experiéncias FLIM sus de tranchas cerebellàrias. En particular, empachar los PNs de regular PCx ​​en naut pòt menar a un estat mai oxidat e accelerar la mòrt cellulara. L'activacion de la degradacion de BCAA e la carboxilacion del piruvat son pas de biaisses de caracterizar los teissuts periferics de la disfoncion mitocondriala (7). Doncas, semblan èsser una caracteristica prioritària de las neurònas deficientas en OXPHOS, quitament se pas la sola caracteristica, qu'es importanta per la neurodegeneracion. .
La malautiá cerebellara es un tipe eterogenèu de malautiá neurodegenerativa que se manifèsta generalament coma ataxia e damatja sovent los PN (46). Aquesta populacion de neurònas es particularament vulnerabla a la disfoncion mitocondriala perque lor degeneracion selectiva dins de mirgas es sufisenta per reproduire fòrça dels simptòmas motors que caracterizan l'ataxia espinocerebellara umana (16, 47, 48). Segon los rapòrts, un modèl de mirga transgenic amb un gèn mutant es associat a l'ataxia espinocerebellara umana e a una disfoncion mitocondriala (49, 50), en soslinhant l'importància d'estudiar las consequéncias de la deficiéncia d'OXPHOS dins PNPH. Es doncas particularament adaptat d'isolar e d'estudiar eficaçament aquela populacion de neurònas unica. Pasmens, vist que los PN son fòrça sensibles a la pression e representan una proporcion bassa de la populacion entièra de cellulas cerebellaras, per fòrça estudis basats sus l'omics, la separacion selectiva d'elas coma de cellulas entièras es encara un aspècte desfisant. E mai s'es gaireben impossible d'aténher una manca absoluda de contaminacion d'autres tipes de cellulas (mai que mai de teissuts adultes), combinèrem una etapa de dissociacion eficaça amb FACS per obténer un nombre sufisent de neurònas viablas per l'analisi proteomica en aval, e aver una cobertura de proteïnas pro nauta (aperaquí 3000 proteïnas) comparada amb l'ensemble de donadas existenta de l'ensemble del cerebèl (15). En preservant la viabilitat de las cellulas entièras, lo metòde que provesèm aicí nos permet non solament de verificar los cambiaments dins las vias metabolicas dins las mitocondrias, mas tanben de verificar los cambiaments dins sas contraparts citoplasmicas, çò que complementa l'utilizacion d'etiquetas de membrana mitocondriala per enriquir lo tipe cellular Lo novèl metòde pel nombre de mitocondrias dins los teissuts complèxes (2555). Lo metòde que descrivèm es pas solament ligat a l'estudi de las cellulas de Purkinje, mas pòt èsser aisidament aplicat a quin tipe que siá de cellula per abordar los cambiaments metabolics dins los cervèls malauts, inclusent d'autres modèls de disfoncion mitocondriala.
Fin finala, avèm identificat una fenèstra terapeutica pendent aquel procès de reorganizacion metabolica que pòt completament inversar los signes claus de l'estrès cellular e prevenir la degeneracion neuronala. Doncas, comprene las implicacions foncionalas del recablament descrich aicí pòt provesir d'informacions fondamentalas sus de tractaments possibles per manténer la viabilitat neuronala pendent la disfoncion mitocondriala. De recèrcas futuras destinadas a analisar los cambiaments dins lo metabolisme de l'energia dins d'autres tipes de cellulas cerebralas son necessàrias per revelar plenament l'aplicabilitat d'aqueste principi a d'autras malautiás neurologicas.
Los mirgas MitoPark son estats descriches prèviament (31). De mirgas C57BL/6N amb de gèns Mfn2 flancants loxP son estadas descrichas prèviament (18) e crosadas amb de mirgas L7-Cre (23). La progenie eterozigòta dobla resultanta foguèt alara crosada amb de mirgas omozigòtas Mfn2loxP/Mfn2loxP per generar de knockouts de gèns especifics de Purkinje per Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Dins un sosensems d'acoblament, l'allèl Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) foguèt introduch a travèrs de crosaments suplementaris (20). Totes los procediments animals foguèron realizats en acòrdi amb las directivas europèas, nacionalas e institucionalas e aprovats per LandesamtfürNatur d'Umwelt e Verbraucherschutz, Ren del Nòrd-Vestfàlia, Alemanha. Lo trabalh dels animals seguís tanben l'orientacion de la Federacion Europèa de las Associacions de las Sciéncias dels Animals de Laboratòri.
Après aver anestesiat la dislocacion cervicala de la femna embarassada, l'embrion de la mirga es isolat (E13). Lo còrtex foguèt dissecat dins una solucion de sal equilibrada de Hanks (HBSS) complementada amb 10 mM de Hepes e transmés sul mitan d'agla modificada de Dulbecco que conteniá de papaïna (20 U/ml) e de cisteïna (1μg/ml). Incubar lo teissut dins DMEM) e lo dissociar per digestion enzimatica. Ml) a 37°C pendent 20 minutas, e puèi fresat mecanicament dins DMEM complementat amb 10% de sèrum bovin fetal. Las cellulas foguèron semenadas sus de cobèrtas de veire cobèrtas de polilisina a una densitat de 2×106 per plat de cultura de 6 cm o a una densitat de 0,5×105 cellulas/cm2 per l'analisi d'imatgeria. Après 4 oras, lo mitan foguèt remplaçat per un mitan sens sèrum Neurobasal que conteniá 1% de suplement B27 e 0,5 mM de GlutaMax. Las neurònas foguèron alara mantengudas a 37°C e 5% de CO2 pendent tota l'experiéncia, e noiridas un còp per setmana. Per induire la recombinacion in vitro, 3μl (plat de cultura de 24 potz) o 0,5μl (placa de 24 potz) del vector virus AAV9 seguent foguèron utilizats per tractar las neurònas lo segond jorn in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numèro de catalòg 105530-AAV9) e AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numèro de catalòg 105545-AAV9).
L'ADN complementari de rat Mfn1 e Mfn2 (obtengut del plasmid Addgene #23212 e #23213, respectivament) son marcats amb la sequéncia V5 (GKPIPNPLLGLDST) al C-terminus, e son fusionats amb mCherry dins l'encastre a travèrs la sequéncia T2A. Grx1-roGFP2 es un present de Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). En remplaçant la casseta tdTomato en utilizant de metòdes de clonacion convencionals, la casseta foguèt sosclonada dins l'espina dorsala pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numèro de referéncia Addgene 28306) per generar pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-G Vectors FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 e pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Una estrategia similara foguèt utilizada per generar lo vector de contraròtle pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Per generar lo construct AAV-shPCx, un vector AAV plasmidic (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) es requerit, que conten la sequéncia d'ADN qu'encoda lo shRNA ciblant lo PCx de la mirga (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGACTTA 3′) Jol contraròtle del promotor U6, mCherry es utilizat jol contraròtle del promotor CMV. La produccion de vectors AAV auxiliars foguèt menada segon las instruccions del fabricant (Cell Biolabs). En resumit, utilizatz un plasmid de transferiment que pòrta mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) Transfeccion transitòria de las cellulas 29A-MFN2-AV5-AV5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gèn codificant, e tanben codificant la proteïna de capsida AAV1 e la proteïna accessòria Plasmid d'embalatge, en utilizant lo metòde de fosfat de calci. Lo subrenatant brut del virus foguèt obtengut per de cicles de congelacion-descongelacion dins un banh de glaç sec/etanòl e de cellulas lisadas dins de salina tamponada amb fosfat (PBS). Lo vector AAV foguèt purificat per ultracentrifugacion discontinua de gradient d'iodixanòl (24 oras a 32 000 rpm e 4°C) e concentrat en utilizant un filtre centrifugal ultra-15 Amicon. Lo títol de genòma d'AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 còpia de genòma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX èra coma descrich prèviament (5), mesurat quantitatiu (PCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) e AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Las neurònas primàrias foguèron rascadas dins un PBS 1x glaçat, pelletadas, e puèi omogeneizadas dins 0,5% Triton X-100 / 0,5% desoxicolat de sòdi/tampon de lisi PBS contenent de fosfatasa e d'inibitor de proteasa (Roche). La quantificacion de las proteïnas foguèt realizada en utilizant l'assaig d'acid bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Las proteïnas foguèron alara separadas per electroforèsi en gel de poliacrilamida SDS, e puèi borradas sus una membrana de fluorur de polivinilidèn (GE Healthcare). Blocar los sites non especifics e incubar amb l'anticòrs primari (veire lo tablèu S1 pels detalhs) dins de lach a 5% dins TBST (salina tamponada Tris amb Tween), d'estapas de lavatge e d'anticòrs segondari dins TBST incubar. Incubar amb d'anticòrs primaris tota la nuèch a +4°C. Après lavatge, aplicatz l'anticòrs segondari pendent 2 oras a temperatura ambienta. Puèi, en incubant lo meteis blot amb un anticòrs anti-β-actina, lo meteis cargament foguèt confirmat. Deteccion en convertissent en quimioluminescéncia e en melhorant la quimioluminescéncia (GE Healthcare).
Las neurònas semenadas prèviament sus de cobèrtas de veire foguèron fixadas amb 4% de paraformaldeïd (PFA)/PBS al moment especificat a temperatura ambienta pendent 10 minutas. Los cobèrts son d'en primièr permeats amb 0,1% Triton X-100/PBS pendent 5 minutas a temperatura ambienta, e puèi dins un tampon de blocatge [3% d'albumina serica bovina (BSA)/PBS]. Lo segond jorn, los cobèrts foguèron lavats amb de tampon de blocatge e incubats amb l'anticòrs segondari conjugat al fluoròfòr apropriat pendent 2 oras a temperatura ambienta; fin finala, los mòstras foguèron lavats a fons dins PBS amb 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) es contracolorat e puèi fixat sus la lamièra del microscòpi amb Aqua-Poly/Mount.
De mirgas (mascles e femèlas) foguèron anestesiadas per injeccion intraperitoneala de ketamina (130 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e administradas subcutanèament amb un analgésic de carprofèn (5 mg/kg), e plaçadas dins un instrument estereotactic (Kopf) equipat d'un paquet caufatge. Expausar lo cran e utilizar un broca dental per aprimar la partida del còrtex cerebellar correspondent a l'òs mis (de lambda: coa 1,8, lateral 1, correspondent als lòbuls IV e V). Utilizatz una agulha de seringa corbada per crear amb precaucion un pichon trauc dins lo cran per evitar de perturbar la vasculatura dejós. Puèi lo capilhar de veire prim tirat es lentament inserit dins lo micro-trauc (de -1,3 a -1 sul costat ventral de la dura matèria), e 200 a 300 nl AAV es injectat dins lo micro-injector (Narishige) amb de seringas manualas (Narishige) divèrsas còps a una pression bassa sus un periòde de temps de fenèstras a 20 a 20 minutas. Après l'infusion, plaçatz lo capilhar pendent 10 minutas de mai per permetre al virus de s'espandir completament. Après que los capilhars son retirats, la pèl es suturada amb precaucion per minimizar l'inflamacion de la nafra e permetre a l'animal de se recuperar. Los animals foguèron tractats amb d'analgésics (caspofen) pendent qualques jorns après l'operacion, pendent lo qual lor estat fisica foguèt soinosament susvelhada e puèi foguèron eutanasiats al moment indicat. Totes los procediments foguèron realizats en acòrdi amb las directivas europèas, nacionalas e institucionalas e foguèron aprovats per LandesamtfürNatur d'Umwelt e Verbraucherschutz, Ren del Nòrd-Vestfàlia, Alemanha.
Los animals foguèron anestesiats amb de ketamina (100 mg/kg) e de xilazina (10 mg/kg), e lo còr foguèt perfusat amb 0,1 M PBS d'en primièr, e puèi amb 4% PFA dins PBS. Lo teissut foguèt dissecat e fixat dins 4% PFA/PBS pendent la nuèch a 4°C. Un cotèl vibrant (Leica Microsystems GmbH, Viena, Àustria) foguèt utilizat per preparar de seccions sagitala (50 μm d'espessor) del cervèl fix dins PBS. Levat se s'especifica pas çò contrari, la coloracion de seccions flotantas liura foguèt realizada coma descrich çai-sus (13) a temperatura ambienta e en agitament. En resumit, d'en primièr, las tranchas obtengudas foguèron permeabilizadas amb 0,5% Triton X-100/PBS pendent 15 minutas a temperatura ambienta; per qualques epitòps (Pcx e Shmt2), en un tampon tris-EDTA a 80°C (PH 9) escalfar las tranchas pendent 25 minutas al luòc d'aquela etapa. Puèi, las seccions foguèron incubadas amb d'anticòrs primari (veire lo tablèu S1) dins un tampon de blocatge (3% BSA/PBS) a 4°C pendent la nuèch amb agitacion. L'endeman, las seccions foguèron lavadas amb de tampon de blocatge e incubadas amb l'anticòrs segondari conjugat al fluoròfòr apropriat pendent 2 oras a temperatura ambienta; fin finala, las seccions foguèron lavadas a fons dins PBS, contracoloradas amb DAPI, e puèi fixadas amb AquaPolymount Sus una lamina de microscòpi.
Un microscòpi confocal d'escanatge laser (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) equipat d'un lasèr de lutz blanca e d'un lasèr ultraviolet de diòde 405 foguèt utilizat per imaginar la mòstra. En excitant lo fluoròfòr e en collectant lo senhal amb lo Detector Ibrid (HyDs), lo logicial LAS-X foguèt utilizat per collectar d'imatges empilhats confòrmes a l'escandalhatge de Nyquist en mòde sequencial: pels panèls non quantitatius, es de senhals fòrça dinamics (per exemple, dins de cellulas somaticas e dendritas) mtYFPD) a detectar lo nombre Hybrid de BPN R mòde). Lo gating de 0,3 a 6 ns es aplicat per reduire lo rèireplan.
Imatgeria en temps real de cellulas triadas. Après triar dins un mitan Neurobasal-A que conteniá 1% de suplement B27 e 0,5 mM de GlutaMax, las cellulas foguèron immediatament semenadas sus de laminas de veire recobertas de poli-l-lisina (μ-Slide8 Ben, Ibidi, numèro de catalòg 80826) , e puèi la gardar a 37°C e 15% de CO pendent una ora per la cellula permetre reglar. L'imatgeria en temps real foguèt realizada sus un microscòpi confocal d'escanatge laser Leica SP8 equipat d'un laser blanc, HyD, d'un objectiu d'òli de 63×[1,4 dobertura numerica (NA)] e d'un estadi de caufatge.
La mirga foguèt rapidament anestesiada amb de dioxid de carbòni e decapitada, lo cervèl foguèt rapidament levat del cran, e talhat en una seccion sagitala de 200μm d'espessor (per l'experiéncia d'etiquetatge 13C) o de 275μm d'espessor (per doas experiéncias de fotons) emplida amb los materials seguents Lo glaç (HM-605, VHer, Scientific Walldorf, Alemanha) es emplenat de las substàncias seguentas: 125 mM glaçat, saturat de carbòni (95% O2 e 5% CO2) bas Ca2 + fluid cerebroespinal artificial (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon de fosfat de sòdi, NaCl 2,5 mM, 25 mM de glusa 0,5 mM CaCl2 e 3,5 mM MgCl2 (pression osmotica de 310 a 330 mmol). Transferir las tranchas de cervèl obtengudas dins una cambra de preincubacion que conten mai de Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon de fosfat de sòdi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucòsa, 10 mM e Ca.20 mM). MgCl2) Mièg) pH 7,4 e 310 a 320 mmol).
Pendent lo procès d'imatge, las tranchas foguèron desplaçadas dins una sala d'imatge dedicada, e l'experiéncia foguèt realizada jos perfusion ACSF continua a una temperatura constanta de 32° a 33°C. Un microscòpi d'escanatge laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) equipat d'una lentilha d'objectiu Leica 25x (NA 0,95, aiga), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) foguèt utilizat per l'imatgeria de tranchas. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM de Grx1-roGFP2. Los cambiaments dins l'estat redox citoplasmic dels PN foguèron mesurats per FLIM de dos fotons dins de talhons de cervèl sagital, ont lo biocaptor Grx1-roGFP2 ciblava los PN. Dins la capa PN, lo camp d'aquisicion es seleccionat d'aperaquí 50 a 80 μm en dejós de la superfícia de la trancha per s'assegurar qu'i a un PN viable (es a dire, la manca d'estructura perlada o de cambiaments morfologics neuronals al long de las dendritas) e lo captor roGFP2 doble positiu e l'AAV qu'encodifican shRNA PCx o sa sequéncia de contraròtle (coexpression de mCx). Reculhir d'imatges de pila unica amb 2x zoom numeric [longitud d'onda d'excitacion: 890 nm; 512 nm 512 pixèls]. Deteccion: HyD intèrne, grop de filtre d'isotiocianat de fluoresceïna (FITC)] e la mejana d'imatge dins 2 a 3 minutas son utilizats per s'assegurar que pro de fotons son collectats (1000 fotons en total) per l'ajustament de la corba. La sensibilitat de la sonda Grx1-roGFP2 e la verificacion de las condicions FLIM foguèron realizadas en susvelhant la valor de durada de vida de roGFP2 al moment d'apondre d'H2O2 exogèn 10 mM a l'ACSF de perfusion (per maximizar l'oxidacion, çò que resulta en una durada de vida aumentada), e puèi en apondent 2 mM de ditiothreit (minuissent lo gra de reduccion, resultant en diminucion de la durada de vida) (Figura S8, D a G). Utilizatz lo logicial FLIMfit 5.1.1 per analisar los resultats aquerits, ajustatz la corba de decadéncia exponenciala unica de l'imatge entièr a l'IRF mesurat (foncion de responsa de l'instrument), e χ2 es aperaquí 1. Per calcular la durada de vida d'un sol PN, la masca a l'entorn del còrs nerviós foguèt traçada manualament, e una durada de vida mejana per cada masca foguèt utilizada.
Analisi de potencial mitocondrial. Après que la seccion aguda foguèt incubada amb 100 nM TMRM apondut dirèctament a l'ACSF perfusat pendent 30 minutas, los cambiaments de potencial mitocondrial de PNs foguèron mesurats per un microscòpi de dos fotons. L'imatgeria TMRM foguèt realizada en excitant la sonda a 920 nm e en utilizant HyD intèrne (isotiocianat de tetrametilrodamina: 585/40 nm) per collectar de senhals; en utilizant la meteissa longor d'onda d'excitacion mas en utilizant un HyD intèrne diferent (FITC :525/50) per imatger mtYFP. Utilizatz lo plug-in Calculator d'imatges d'ImageJ per avalorar lo potencial mitocondrial al nivèl de la cellula unica. En resumit, l'equacion plug-in: signal = min (mtYFP, TMRM) es utilizada per identificar la region mitocondriala que mòstra lo senhal TMRM en Purkinje Somali dins l'imatge confocal de pila unica del canal correspondent. Puèi l'airal de pixèl dins la masca resultanta es quantificat, e puèi normalizat sus l'imatge de pila unica de lindal correspondent del canal mtYFP per obténer la fraccion mitocondriala mostrant lo potencial mitocondrial.
L'imatge foguèt desconvolut amb lo logicial Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Per las imatges escanejadas de teulas, lo montatge d'una sola teula es fach en utilizant l'algoritme de costura automatica provesit pel logicial LAS-X. Après l'etalonatge de l'imatge, utilizatz ImageJ e Adobe Photoshop per tractar mai l'imatge e ajustar uniformament la luminositat e lo contraste. Utilizatz Adobe Illustrator per la preparacion grafica.
Analisi de focus de mtDNA. Lo nombre de lesions d'ADNmt foguèt quantificat sus de seccions cerebellaras marcadas amb d'anticòrs contra l'ADN per un microscòpi confocal. Cada airal cibla foguèt creat pel còrs de la cellula e lo nuclèu de cada cellula, e l'airal respectiu foguèt calculat en utilizant lo plug-in Multi Measure (logicial ImageJ). Restar l'airal nuclear de l'airal del còrs cellular per obténer l'airal citoplasmatic. Fin finala, lo plug-in Analyze Particles (logicial ImageJ) foguèt utilizat per quantificar automaticament los punts d'ADN citoplasmic indicant mtDNA sus l'imatge de lindal, e los resultats obtenguts foguèron normalizats a la mejana PN de las mirgas CTRL. Los resultats son exprimits coma lo nombre mejan de nucleosids per cellula.
Analisi d'expression de proteïna. Utilizatz lo plug-in Calculator d'imatges d'ImageJ per avalorar l'expression de proteïnas dins PN al nivèl de cellula unica. En resumit, dins l'imatge confocal d'una sola capa del canal correspondent, a travèrs l'equacion: senhal = min (mtYFP, anticòrs), la region mitocondriala que mòstra immunoreactivitat a un cèrt anticòrs dins Purkina es identificada. Puèi l'airal de pixèl dins la masca resultanta es quantificat, e puèi normalizat sus l'imatge de pila unica de lindal correspondent del canal mtYFP per obténer la fraccion mitocondriala de la proteïna afichada.
Analisi de la densitat cellulara de Purkinje. Lo plug-in Cell Counter d'ImageJ foguèt utilizat per avalorar la densitat de Purkinje en divisant lo nombre de cellulas de Purkinje comptadas per la longor de l'anèl cerebellar ocupat per las cellulas comptadas.
Preparacion e collecta de mòstras. Los cervèls del grop de contraròtle e de las mirgas Mfn2cKO foguèron fixats dins 2% PFA/2,5% glutaraldeïd dins 0,1 M de tampon fosfat (PB), e puèi de seccions coronalas foguèron preparadas en utilizant de ciliats (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Àustria) (Espessor de 50 a 60 μm) Lo tampon de fixacion dins 1% de PB tetraoxid e 1,5% de ferrocianur de potassi a temperatura ambienta pendent 1 ora. Las seccions foguèron lavadas tres còps amb d'aiga destillada, e puèi coloradas amb 70% d'etanòl que conteniá 1% d'acetat d'uranil pendent 20 minutas. Las seccions foguèron alara desidratadas dins d'alcòl graduat e encastradas dins de resina epoxi Durcupan ACM (resina de fosa d'Araldita M) (Sciéncias de Microscopia Electronica, numèro de catalòg 14040) entre de lames de veire recobertas de silici, e fin finala a 60°C polimerizadas dins lo forn pendent 48 oras. L'airal del còrtex cerebellar foguèt seleccionat e de seccions ultraprimas de 50 nm foguèron talhadas sus Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Àustria) e picadas sus una grasilha de fenda de coire de 2×1 mm recoberta de filme de poliestirèn. Las seccions foguèron coloradas amb una solucion d'acetat uranil a 4% dins H2O pendent 10 minutas, lavadas amb H2O divèrsas còps, puèi amb de citrat de plomb de Reynolds dins H2O pendent 10 minutas, e puèi lavadas amb H2O divèrsas còps. Las micrografas foguèron presas amb un microscòpi electronic de transmission Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) en utilizant una camèra numerica TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Alemanha).
Per las mirgas infectadas amb AAV, lo cervèl foguèt separat e talhat dins una seccion sagitala d'1 mm d'espessor, e lo cerebèl foguèt examinat en utilizant un microscòpi de fluorescéncia per identificar l'anèl infectat per AAV (es a dire, exprimissent mCherry). Sonque d'experiéncias que l'injeccion AAV resulta en una eficiéncia de transduccion fòrça nauta de la capa cellulara de Purkinje (es a dire gaireben tota la capa) dins al mens dos anèls cerebellars consecutius son utilizadas. Lo bucle transdusit per AAV foguèt microdissecat per una post-fixacion pendent la nuèch (4% PFA e 2,5% glutaraldeïd dins un tampon de cacaut 0,1 M) e tractat mai enlà. Per l'encastrement EPON, lo teissut fixe foguèt lavat amb 0,1 M de tampon de cacaut sòdi (Applichem), e incubat amb 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) dins 0,1 M de tampon de cacaut de sòdi (Applichem) 4 oras, puèi lavat pendent 2 oras. Repetir 3 còps amb un tampon de cocamida 0,1 M. Puèi, la seria ascendenta d'etanòl foguèt utilizada per incubar cada solucion d'etanòl a 4°C pendent 15 minutas per deshidratar lo teissut. Lo teissut foguèt transferit a l'oxid de propilèn e incubat tota la nuèch dins EPON (Sigma-Aldrich) a 4°C. Plaçatz lo teissut dins un EPON fresc a temperatura ambienta pendent 2 oras, e puèi l'encastratz a 62°C pendent 72 oras. Utilizatz un ultramicrotòma (Leica Microsystems, UC6) e un cotèu de diamant (Diatome, Biel, Soïssa) per talhar de seccions ultraprimas de 70 nm, e coloratz amb 1,5% d'acetat d'uranila pendent 15 minutas a 37°C, e coloratz amb una solucion de citrat de plomb 4 minutas. Las micrografas electronicas foguèron presas en utilizant un microscòpi electronic de transmission JEM-2100 Plus (JEOL) equipat de Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) e de logicials DigitalMicrograph (Gatan). Per l'analisi, de micrografas electronicas foguèron aqueridas amb un zoom numeric 5000× o 10 000×.
Analisi morfologica de las mitocondrias. Per totas las analisis, los contorns de las mitocondrias individualas foguèron esboçats manualament dins d'imatges numerics en utilizant lo logicial ImageJ. Diferents paramètres morfologics son analizats. La densitat mitocondriala es exprimida coma un percentatge obtengut en divisant l'airal mitocondrial total de cada cellula per l'airal del citoplasma (airal del citoplasma = airal de cellula-airal del nuclèu cellular) × 100. La redondesa de las mitocondrias es calculada amb la formula [4π∙(airal/perimètre 2)]. La morfologia de l'ista de las mitocondrias foguèt analizada e dividida en doas categorias ("tubulara" e "bossa") segon lors formas principalas.
Analisi de nombre e densitat d'autofagosòmas/lisosòmas. Utilizatz lo logicial ImageJ per esboçar manualament los contorns de cada autofagosòma/lisosòma dins l'imatge numeric. L'airal d'autofagosòma/lisosòma es exprimit coma un percentatge calculat en divisant l'airal total d'estructura autofagosòma/lisosòma de cada cellula per l'airal del citoplasma (airal del citoplasma=airal de cellula-airal de nuclèu)×100. La densitat dels autofagosòmas/lisosòmas es calculada en divisant lo nombre total pel nombre d'estructuras autofagosòmas/lisosòmas per cellula (en tèrmes d'airal citoplasmatic) (airal citoplasmatic = airal de cellula-airal nuclear).
Etiquetatge per la seccionacion aguda e la preparacion de la mòstra. Per d'experiéncias que demandan l'etiquetatge de glucòsa, transferissètz las tranchas cerebralas agudas dins una cambra de preincubacion, que conten de carbòni saturat (95% O2 e 5% CO2), de Ca2 + ACSF naut (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM de tampon de fosfat sòdi, 2,5 mM de NaCl, 200 mM. d-glucòsa, 1,0 mM CaCl 2 e 2,0 mM MgCl 2, ajustat a pH 7,4 e 310 a 320 mOsm), que la glucòsa es 13 C 6- Substitucion de glucòsa (Eurisotop, numèro de catalòg CLM-1396). Per d'experiéncias que demandan d'etiquetatge de piruvat, transferissètz las tranchas cerebralas agudas a un ACSF de Ca2 + mai naut (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM de tampon de fosfat de sòdi, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM d-glucòsa, 10 mM d-glucòsa, 10 mM e Ca. MgCl2, ajustar a pH 7,4 e 310 a 320mOsm), e apondre 1mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, numèro de catalòg CLM-1082). Incubar las seccions pendent 90 minutas a 37°C. A la fin de l'experiéncia, las seccions foguèron rapidament lavadas amb una solucion aquosa (pH 7,4) contenent 75 mM de carbonat d'amoni, e puèi omogeneizadas dins 40:40:20 (v:v:v) d'acetonitril (ACN): metanòl: aiga. Après que las seccions foguèron incubadas sus glaç pendent 30 minutas, los mòstras foguèron centrifugats a 21 000 g pendent 10 minutas a 4°C, e lo subrenadant clar foguèt secat dins un concentrator SpeedVac. Lo pellet de metabolit sec resultant foguèt emmagazinat a -80°C fins a l'analisi.
Cromatografia liquida-analisi d'espectrometria de massa de 13 aminoacids marcats C. Per l'analisi de cromatografia liquida-espectrometria de massa (LC-MS), lo pellet de metabolit foguèt resuspendut dins 75μl d'aiga de qualitat LC-MS (Honeywell). Après centrifugacion a 21 000 g pendent 5 minutas a 4°C, 20 μl del subrenadant clarificat foguèron utilizats per l'analisi del flux d'aminoacids, del temps que lo rèsta de l'extrach foguèt immediatament utilizat per l'analisi d'anions (veire çai-jos). L'analisi d'aminoacids foguèt realizada en utilizant lo protocòl de derivatizacion de clorur de benzoïl descrich prèviament (55, 56). Dins la primièra etapa, 10μl de carbonat de sòdi 100 mM (Sigma-Aldrich) foguèt apondut a 20μl d'extrach de metabolit, e puèi 10μl de clorur de benzoil 2% (Sigma-Aldrich) foguèt apondut a l'ACN de gra LC. Lo mòstra foguèt vortexat brèvament e puèi centrifugat a 21 000 g pendent 5 minutas a 20°C. Transferir lo subrenadant netejat dins un fial d'automostraire de 2 ml amb un insert de veire conic (200 μl de volum). Los mòstras foguèron analizats en utilizant lo sistèma LC ultra-nauta performància Acquity iClass (Waters) connectat a l'espectromètre de massa de precision de nauta resolucion Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Per l'analisi, 2μl de la mòstra derivada foguèt injectat dins una colomna T3 de silice de nauta resisténcia de 100×1,0 mm (Waters) que conteniá de particulas de 1,8μm. Lo debit es de 100μl/min, e lo sistèma tampon consistís en tampon A (10 mM de format d'amoni e 0,15% d'acid formic dins l'aiga) e tampon B (ACN). Lo degradat es lo seguent: 0%B a 0 minutas; 0%B. 0 a 15% B a 0 a 0,1 minutas; 15 a 17% B a 0,1 a 0,5 minutas; B a 17 a 55% a 0,5 a 14 minutas; B a 55 a 70% a 14 a 14,5 minutas; a 14,5 a 70 a 100% B a 18 minutas; 100% B a 18 a 19 minutas; 100 a 0% B a 19 a 19,1 minutas; 0% B a 19,1 a 28 minutas (55, 56). L'espectromètre de massa QE-HF fonciona en mòde d'ionizacion positiva amb un interval de massa de m/z (rapòrt massa/carga) de 50 a 750. La resolucion aplicada es de 60 000, e la tòca d'ions de contraròtle de ganh (AGC) obtenguda es de 3×106, e lo temps d'ions maximal es de 10 000 milisconds. La font d'ionizacion d'electropulverizacion cauda (ESI) fonciona a una tension de pulverizacion de 3,5 kV, una temperatura capillara de 250°C, un flux d'aire de vaina de 60 AU (unitats arbitràrias), e un flux d'aire auxiliar de 20 AU. 250°C. L'objectiu S es fixat a 60 AU.
Cromatografia aniònica-analisi MS d'acids organics marcats 13C. Lo precipitat de metabolit restant (55μl) foguèt analizat en utilizant un sistèma de cromatografia d'ions Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) connectat a un espectromètre de massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). En resumit, 5μl d'extrach de metabolit foguèt injectat dins una colomna Dionex IonPac AS11-HC equipada de HPLC (2 mm×250 mm, talha de particula 4μm, Thermo Fisher Scientific) en mòde de bocla parciala push-in amb un rapòrt de rempliment de 1. ) Colomna Dionex IonPac AG11-HC mm, colomna garda HC mm x250 mm, 250 mm 4μm, Thermo Fisher Scientific). La temperatura de la colomna es mantenguda a 30°C, e l'automostraire es fixat a 6°C. Utilizatz un cartucho d'idroxid de potassi provesit d'aiga desionizada per generar un gradient d'idroxid de potassi a travèrs lo generator d'eluent. Separacion dels metabolits a un debit de 380μl/min, en aplicant lo gradient seguent: 0 a 3 minutas, 10 mM KOH; 3 a 12 minutas, 10 a 50 mM de KOH; 12 a 19 minutas, 50 a 100 mM de KOH; 19 a 21 minutas, 100 mM KOH; 21 a 21,5 minutas, 100 a 10 mM de KOH. La colomna foguèt reequilibrada jos 10 mM KOH pendent 8,5 minutas.
Los metabolits eluits son combinats amb un flux de suplement d'isopropanòl de 150μl/min après la colomna e puèi dirigits cap a un espectromètre de massa de nauta resolucion foncionant en mòde d'ionizacion negativa. MS susvelha la gamma de massa de m/z 50 a 750 amb una resolucion de 60 000. L'AGC es fixat a 1×106, e lo temps d'ion maximal es mantengut a 100 ms. La font ESI caufada èra operada a una tension de pulverizacion de 3,5 kV. Los autres paramètres de la font d'ions son los seguents: temperatura capilara 275°C; flux de gas de vaina, 60 UA; flux de gas auxiliar, 20 AU a 300°C, e ajustament de la lentilha S a 60 AU.
Analisi de donadas de metabolits marcats 13C. Utilizatz lo logicial TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) per l'analisi de donadas del rapòrt d'isotòps. L'identitat de cada compausat foguèt verificada per un compausat de referéncia fisable e analizada independentament. Per fin de realizar l'analisi d'enriquiment d'isotòps, l'airal del cromatograma d'ions extrach (XIC) de cada isotòp 13C (Mn) foguèt extrach de [M + H] +, ont n es lo nombre de carbòni del compausat cibla, utilizat per analisar los aminoacids o [ MH] + es utilizat per analisar los anions. La precision de massa de XIC es inferiora a cinc parts per milion, e la precision de RT es de 0,05 minutas. L'analisi d'enriquiment es realizada en calculant lo rapòrt de cada isotòp detectat a la soma de totes los isotòps del compausat correspondent. Aquestes rapòrts son donats coma de valors percentualas per cada isotòp, e los resultats son exprimits coma enriquiment en percentatge molar (MPE), coma descrich prèviament (42).
Lo pellet de neuròna gelat foguèt omogeneizat dins de metanòl a 80% glaçat (v/v), vortexat, e incubat a -20°C pendent 30 minutas. Vortexatz la mòstra de nòu e remenatz a +4°C pendent 30 minutas. Lo mòstra foguèt centrifugat a 21 000 g pendent 5 minutas a 4°C, e puèi lo subrenatant resultant foguèt collectat e secat en utilizant un concentrator SpeedVac a 25°C per una analisi seguenta. Coma descrich çai-sus, l'analisi LC-MS foguèt realizada suls aminoacids de las cellulas triadas. En utilizant TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific), l'analisi de donadas foguèt realizada en utilizant la massa monoisotòpica de cada compausat. La normalizacion quantila de las donadas de metabolits foguèt realizada en utilizant lo paquet logicial preprocessCore (57).
Preparacion de las tranchas. La mirga foguèt rapidament anestesiada amb de dioxid de carbòni e decapitada, lo cervèl foguèt rapidament levat del cran, e lo cotèu vibrant emplenat de glaç (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemanha) foguèt utilizat per lo talhar en seccions sagitala de 300 a 375 μm de gasificacion de carbòni e COd de freg (25% 25) Ca2 + ACSF bas (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon de fosfat sòdi, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucòsa, 1,0 mM CaCl2 e 6,0 mM MgCl2 Ajustatz a pH 4 e 30 mM 30). Transferir las tranchas de cervèl obtengudas dins una cambra que conten mai de Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM de tampon de fosfat de sòdi, 25,0 mM de NaHCO3, 25,0 mM de d-glucòsa, 4,0 mM de Ca2 mM e de pH 5,5 mM) 7,4 e 310 a 320 mOsm). Conservatz las tranchas pendent 20 a 30 minutas per que pòscan èsser restauradas abans l'enregistrament.
enregistrament. Un estadi de microscòpi equipat d'una cambra d'enregistrament fixa e d'una lentilha d'objectiu d'immersion en aiga 20x (Scientifica) foguèt utilizada per totes los enregistraments. Las cellulas putativas de Purkinje foguèron identificadas per (i) la talha del còrs, (ii) l'emplaçament anatomic del cerebèl, e (iii) l'expression del gèn reportaire mtYFP fluorescent. La pipeta de pegat amb una resisténcia de punta de 5 a 11 megohms es tirada per un capilhar de veire borosilicat (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Alemanha) e una pipeta orizontala Instruments (P-10000), Sutterva, CA). Totes los enregistraments foguèron realizats per l'amplificator de pinça de parche npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Alemanha), qu'èra contrarotlat pel logicial Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). L'experiéncia foguèt enregistrada a un taus d'escandalhatge de 12,5 kHz. Lo senhal es filtrat amb dos filtres Bessel de passatge cort amb de frequéncias de talh de 1,3 e 10 kHz respectivament. La capacitància de la membrana e de la pipeta es compensada pel circuit de compensacion en utilizant l'amplificator. Totas las experiéncias foguèron realizadas jos lo contraròtle d'una camèra Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemanha), qu'èra contrarotlada pel logicial Hokawo (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemanha).
Configuracion e analisi de rotina de la cellula entièra. Immediatament abans d'enregistrar, emplenatz la pipeta amb la solucion intèrna que conten las substàncias seguentas: 4,0 mM de KCl, 2,0 mM de NaCl, 0,2 mM d'EGTA, 135,0 mM de gluconat de potassi, 10,0 mM de Hepes, 4,0 mM d'ATP (5MM), de 5 MM de trifosit. (GTP) (Na) e 10,0 mM de fosfat de creatinina foguèron ajustats a pH 7,25, e la pression osmotica èra de 290 mOsm (sacarosa). Immediatament après aver aplicat una fòrça de 0 pA per rompre la membrana, lo potencial de la membrana de repaus foguèt mesurat. La resisténcia d'entrada es mesurada en aplicant de corrents iperpolarizats de -40, -30, -20, e -10 pA. Mesurar la magnitud de la responsa de tension e utilizar la lei d'Ohm per calcular la resisténcia d'entrada. L'activitat espontanèa foguèt enregistrada dins una pinça de tension pendent 5 minutas, e sPSC foguèt identificat e mesurat dins Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) en utilizant un script de reconeissença semiautomatica. La corba IV e lo corrent d'estat estacionari son mesurats en serrant la batariá a de potencials diferents (a partir de -110 mV) e en aumentant la tension en estapas de 5 mV. La produccion d'AP foguèt testada en aplicant un corrent despolarizant. Pinçatz la cellula a -70 mV del temps qu'aplicatz un impuls de corrent despolarizant. Ajuste la talha de pas de cada unitat d'enregistrament per separat (10 a 60 pA). Calculatz la frequéncia AP maximala en comptant manualament los pics de pols que causan la frequéncia AP mai nauta. Lo lindal AP es analizat en utilizant la segonda derivada de l'impulsion de despolarizacion que desencadena d'en primièr una o mai AP.
Configuracion e analisi de pegatge traucat. Realizar l'enregistrament de pegats traucats en utilizant de protocòls estandard. Utilizatz una pipeta sens ATP e GTP que conten pas los ingredients seguents: 128 mM de gluconat K, 10 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 0,1 mM d'EGTA e 2 mM de MgCl2, e ajustatz a pH 7,2 (en utilizant KOH). L'ATP e lo GTP son omeses de la solucion intracellulara per prevenir la permeabilitat incontrolada de la membrana cellulara. La pipeta de parche es emplenada amb una solucion intèrna contenent d'anfotericina (aperaquí 200 a 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) per obténer un enregistrament de pegat perforat. L'anfotericina foguèt dissolguda dins de sulfoxid de dimetil (concentracion finala: 0,1 a 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). La concentracion de DMSO utilizada aguèt pas cap d'efièch significatiu sus las neurònas estudiadas. Pendent lo procès de perforacion, la resisténcia del canal (Ra) foguèt susvelhada de contunh, e l'experiéncia foguèt començada après que l'amplitud de Ra e AP estabilizadas (20-40 minutas). L'activitat espontanèa es mesurada dins una pinça de tension e/o de corrent pendent 2 a 5 minutas. L'analisi de donadas foguèt realizada en utilizant Igor Pro (version 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (version 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) e GraphPad Prism (version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Estats Units). Per identificar los AP espontanèus, lo plug-in NeuroMatic v3.0c d'IgorPro es utilizat. Identificar automaticament los AP en utilizant un lindal donat, qu'es ajustat individualament per cada enregistrament. En utilizant l'interval de pic, determinatz la frequéncia de pic amb la frequéncia de pic instantanèa maximala e la frequéncia de pic mejana.
Isolament PN. En s'adaptant al protocòl publicat prèviament, los PNs foguèron purificats del cerebèl de la mirga a un estadi especificat (58). En resumit, lo cerebèl foguèt dissecat e picat dins un mitan de dissociacion glaçat [sens HBSS Ca2+ e Mg2+, complementat amb 20 mM de glucòsa, de penicillina (50 U/ml) e d'estreptomicina (0,05 mg/ml)], e puèi digerit lo mitan dins de papain [HBSS, suplementat amb esteïna HBSS, 1·1 (1 mg / ml), papaïna (16 U / ml) e desoxirribonucleasa I (DNasa I; 0,1 mg/ml)] Tractar pendent 30 minutas a 30°C. D'en primièr, lavatz los teissuts dins un mitan HBSS que conten de moc d'uòu (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) e DNasa (0,1 mg/ml) a temperatura ambienta per prevenir la digestion enzimatica, e puèi dins lo mitan HBSS que conten 20 mM de glucòsa Molint doçament dins HBSS, peilin/ml/ml, strep (0,05 mg/ml) e la DNasa (0,1 mg/ml) liberan de cellulas solas. La suspension cellulara resultanta foguèt filtrada a travèrs un colador de cellulas de 70μm, puèi las cellulas foguèron pelletadas per centrifugacion (1110 rpm, 5 minutas, 4°C) e resuspendadas dins un mitan de triatge [HBSS, complementat amb 20 mM de glucòsa, 20% de bovin fetal) Sèrum de pelina (500/5) e estrecopia (0,05 mg/ml)]; avalorar la viabilitat cellulara amb iodur de propidi e ajustar la densitat cellulara a 1×106 a 2×106 cellulas/ml. Abans la citometria de flux, la suspension foguèt filtrada a travèrs un colador de cellulas de 50 μm.
Citomètre de flux. Lo triatge cellular foguèt realizat a 4°C en utilizant la maquina FACSAria III (BD Biosciences) e lo logicial FACSDiva (BD Biosciences, version 8.0.1). La suspension cellulara foguèt triada en utilizant una boca de 100 μm jos una pression de 20 psi a un ritme de ~2800 eveniments/sec. Coma los critèris de portada tradicionals (talha de cellula, discriminacion bimodala, e caracteristicas de dispersion) pòdon pas assegurar l'isolament corrècte de PN d'autres tipes de cellulas, l'estrategia de portada es fixada en foncion de la comparason dirècta de l'intensitat e de l'autofluorescéncia YFP dins los mirons mitoYFP+ ​​e lo mitoYFP − de contraròtle. YFP es excitat en irradiant la mòstra amb una linha laser de 488 nm, e lo senhal es detectat en utilizant un filtre de passatge de benda de 530/30 nm. Dins las mirgas mitoYFP+, la fòrça relativa del gèn reportaire Rosa26-mitoYFP es tanben utilizada per destriar los fragments de còrs neuronal e d'axon. 7-AAD es excitat amb un lasèr jaune de 561 nm e detectat amb un filtre de passa-banda de 675/20 nm per exclure las cellulas mòrtas. Per separar los astrocits al meteis temps, la suspension cellulara foguèt colorada amb ACSA-2-APC, puèi la mòstra foguèt irradiada amb una linha laser de 640 nm, e un filtre de passatge de banda de 660/20 nm foguèt utilizat per detectar lo senhal.
Las cellulas collectadas foguèron pelletizadas per centrifugacion (1110 rpm, 5 minutas, 4°C) e emmagazinadas a -80°C fins a l'utilizacion. Los mirgas Mfn2cKO e lors pichons de pòcha son classats lo meteis jorn per minimizar la variabilitat procedurala. La presentacion e l'analisi de las donadas FACS foguèron realizadas en utilizant lo logicial FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Coma mencionat çai-sus (59), la PCR en temps real es utilizada per isolar l'ADN de las neurònas triadas per la quantificacion seguenta de l'ADNmt. La linearitat e la sensibilitat al lindal foguèron inicialament testadas en executant de qPCR sus diferents nombres de cellulas. En resumit, collectatz 300 PN dins un tampon de lisi consistent en 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 e proteinasa K (200 ng/ml) e incubatz a 55°C 120 minutas. Las cellulas foguèron mai incubadas a 95°C pendent 10 minutas per assegurar una inactivacion completa de la proteinasa K. En utilizant una sonda TaqMan (Thermo Fisher) especifica a mt-Nd1, l'ADN mt foguèt mesurat per PCR semi-quantitativa dins lo sistèma de PCR en temps real 7900HT (Thermoherific Scientifics). Sciéncia, numèro de catalòg Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numèro de catalòg AIVI3E8) e 18S (Thermo Fisher Scientific, numèro de catalòg Hs99999901_s1) gèns.
Preparacion de mòstra de proteòma. En calfant la solucion a 95°C pendent 10 minutas e en sonicant, dins lo tampon de lisi [6 M de clorur de guanidina, 10 mM de cloridro de fosfina de tris(2-carboxietil), 10 mM de cloroacetamida e 100 mM de tris-lisa de pellets de neurònas congeladas dins de HC]. Sus Bioruptor (Diagenode) pendent 10 minutas (30 segondas de pols / 30 segondas de pausa). Lo mòstra foguèt diluit 1:10 dins 20 mM tris-HCl (pH 8,0), mesclat amb 300 ng d'aur tripsina (Promega), e incubat tota la nuèch a 37°C per obténer una digestion completa. Lo segond jorn, lo mòstra foguèt centrifugat a 20 000 g pendent 20 minutas. Lo subrenadant foguèt diluit amb 0,1% d'acid formic, e la solucion foguèt desalenada amb StageTips autofabricats. Lo mòstra foguèt secat dins un instrument SpeedVac (concentrator Eppendorf mai 5305) a 45°C, e puèi lo peptid foguèt suspendut dins d'acid formic a 0,1%. Totas las mòstras foguèron preparadas a l'encòp per la meteissa persona. Per analisar de mòstras d'astrocits, 4 μg de peptides dessalats foguèron etiquetats amb una etiqueta de massa en tandem (TMT10plex, numèro de catalòg 90110, Thermo Fisher Scientific) amb un rapòrt peptide a reactiu TMT de 1:20. Per l'etiquetatge TMT, 0,8 mg de reactiu TMT foguèt resuspendut dins 70 μl d'ACN anidr, e lo peptid sec foguèt reconstituit en 9 μl de 0,1 M TEAB (bicarbonat de trietilamòni), al qual 7 μl de reactiu TMT en ACN foguèt apondut. La concentracion èra de 43,75%. Après 60 minutas d'incubacion, la reaccion foguèt apagada amb 2 μl d'idroxilamina a 5%. Los peptides marcats foguèron collectats, secats, resuspenduts dins 200μl d'acid formic (AF) a 0,1%, dividits en dos, e puèi desalenats en utilizant StageTips autofabricats. En utilizant un cromatograf liquid ultra naut rendiment UltiMate 3000 (cromatograf liquid ultra naut rendiment UltiMate 3000), una de las doas mitats foguèt fraccionada sus una colomna cromatografica Acquity de 1mm x 150mm emplida de particulas C18 de 130Å1,7μm (Waters, catalòg SKU: 196666). Thermo Fisher Scientific). Separar los peptides a un debit de 30μl/min, separar de 1% a 50% de tampon B pendent 85 minutas amb un gradient pas a pas de 96 minutas, de 50% a 95% de tampon B pendent 3 minutas, puèi 8 minutas pel tampon B de 95%; Lo tampon A es 5% ACN e 10 mM de bicarbonat d'amoni (ABC), e lo tampon B es 80% ACN e 10 mM ABC. Reculhisson de fraccions cada 3 minutas e las combinatz en dos grops (1 + 17, 2 + 18, etc.) e las secatz dins una centrifuga al vuèg.
Analisi LC-MS/MS. Per l'espectrometria de massa, los peptides (nombre r119.aq) foguèron separats sus una colomna analitica PicoFrit de 25 cm, 75 μm de diamètre interior (novèla lentilha d'objectiu, numèro de pèça PF7508250) equipada de 1,9 μm de mitan ReproSil-Pur 120 C18-AQD (Maischr, Mais-Y, Mais-YAS). 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemanha). La colomna foguèt mantenguda a 50°C. Los tampons A e B son 0,1% d'acid formic dins l'aiga e 0,1% d'acid formic dins 80% d'ACN, respectivament. Los peptides foguèron separats de 6% a 31% de tampon B pendent 65 minutas e de 31% a 50% de tampon B pendent 5 minutas amb un gradient de 200 nl/min. Los peptides eluits foguèron analizats sus un espectromètre de massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). La mesura m/z del precursor de peptid es realizada amb una resolucion de 120 000 dins l'interval de 350 a 1500 m/z. En utilizant 27% d'energia de collision normalizada, lo precursor mai fòrt amb un estat de carga de 2 a 6 es seleccionat per la scission de dissociacion de trapèla C (HCD) d'alta energia. Lo temps de cicle es fixat a 1 s. La valor m/z del fragment de peptid foguèt mesurada dins la trapèla d'ions en utilizant la cibla AGC mai pichona de 5×104 e lo temps d'injeccion maximal de 86 ms. Après la fragmentacion, lo precursor foguèt plaçat sus la lista d'exclusion dinamica pendent 45 s. Los peptides marcats amb TMT foguèron separats sus una colomna Acclaim PepMap de 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numèro de catalòg 164942), e los espectres de migracion foguèron analizats sus un espectromètre de massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) equipat d'una forma d'onda nauta simetrica (IMS) l'equipament (Thermo Fisher Scientific) fonciona a doas tensions de compensacion de −50 e −70 V. MS3 seleccionat en foncion del precursor de sincronizacion es utilizat per la mesura del senhal d'ions del rapòrt TMT. La separacion peptidica foguèt realizada sus EASY-nLC 1200, en utilizant una elucion de gradient linear de 90%, amb una concentracion de tampon de 6% a 31%; lo tampon A èra 0,1% FA, e lo tampon B èra 0,1% FA e 80% ACN. La colomna analitica es operada a 50°C. Utilizatz FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) per dividir lo fichièr original segon la tension de compensacion FAIMS.
Identificacion e quantificacion de proteïnas. En utilizant lo motor de recèrca integrat Andromeda, las donadas originalas foguèron analizadas en utilizant MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). En mai de las sequéncias Cre recombinasa e YFP obtengudas d'Aequorea victoria, d'espèctres de fragments de peptides foguèron cercats per la sequéncia canonica e la sequéncia d'isoforma del proteòma de referéncia de la mirga (Proteome ID UP000000589, telecargat d'UniProt en mai de 2017) . L'oxidacion de la metionina e l'acetilacion N-terminala de la proteïna foguèron fixadas coma de modificacions variablas; la metilacion del carbamoil de cisteïna foguèt fixada coma de modificacions fixas. Los paramètres de digestion son definits a "especificitat" e "tripsina/P". Lo nombre minimal de peptides e peptides de rasoir utilizats per l'identificacion de proteïnas es 1; lo nombre minimal de peptides unics es 0. Dins las condicions de correspondéncia de mapa de peptides, lo taus d'identificacion de proteïnas èra de 0,01. L'opcion "Segond peptid" es activada. Utilizatz l'opcion "correspondéncia entre execucions" per transferir d'identificacions capitadas entre diferents fichièrs originals. Utilizatz lo compte de rapòrt minimal LFQ 1 per la quantificacion sens etiqueta (LFQ) (60). L'intensitat LFQ es filtrada per al mens doas valors validas dins al mens un grop de genotipe a cada punt de temps, e es extrapolada a partir d'una distribucion normala amb una largor de. 0,3 e davalar 1,8. Utilizatz la plataforma informatica Perseus (https://maxquant.net/perseus/) e R (https://r-project.org/) per analisar los resultats LFQ. Un tèst t moderat bidireccional del paquet logicial limma foguèt utilizat per l'analisi d'expression diferenciala (61). L'analisi de donadas exploratòrias es realizada en utilizant ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally e pheatmap. Las donadas proteomicas basadas sus TMT foguèron analizadas en utilizant MaxQuant version 1.6.10.43. Cercar de donadas de proteomica bruta de la basa de donadas de proteomica umana d'UniProt, que foguèt telecargada en setembre de 2018. L'analisi inclutz lo factor de correccion de puretat d'isotòp provesit pel fabricant. Utilizar limma en R per l'analisi d'expression diferenciala. Las donadas originalas, los resultats de recèrca de basa de donadas, e lo flux de trabalh e los resultats d'analisi de donadas son totes emmagazinats dins l'aliança ProteomeXchange a travèrs lo depaus partenari PRIDE amb l'identificant de l'ensemble de donadas PXD019690.
Las anotacions foncionalas enriquisson l'analisi. L'aisina d'analisi de la via d'engenh (QIAGEN) foguèt utilizada per determinar la riquesa dels tèrmes d'anotacion foncionala de l'ensemble de donadas a 8 setmanas (Figura 1). En resumit, la lista de proteïnas quantitativas obtengudas de l'analisi de donadas LC-MS/MS (espectrometria de massa en tandem) es utilizada amb los critèris de filtre seguents: Mus musculus es seleccionat coma espècia e fons, e la categoria mòstra que la valor P ajustada per Benjamini per l'enriquiment 0,05 o inferiora es considerada significativa. Per aqueste grafic, las cinc categorias d'excès màgers dins cada cluster basadas sus la valor P ajustada son mostradas. En utilizant un t-test multiple, en utilizant lo programa d'impulsion linear en doas estapas de Benjamini, Krieger, e Yekutieli (Q = 5%), l'analisi d'expression de proteïnas de cors temporal es realizada suls candidats importants identificats dins cada categoria, e cada linha es analizada separadament. I a pas besonh d'adoptar un SD coerent.
Per fin de comparar los resultats d'aqueste estudi amb de basas de donadas publicadas e generar un diagrama de Venn dins la Figura 1, combinèrem la lista de proteïnas quantitativas amb las anotacions MitoCarta 2.0 (24). Utilizatz l'aisina en linha Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) per generar lo diagrama.
Per d'informacions detalhadas suls procediments estatistics utilizats per l'analisi proteomica, mercés de consultar la seccion correspondenta de Materials e Metòdes. Per totas las autras experiéncias, d'informacions detalhadas pòdon èsser trobadas dins la legenda correspondenta. Levat se s'especifica autrament, totas las donadas son exprimidas coma mejana ± SEM, e totas las analisis estatisticas foguèron efectuadas en utilizant lo logicial GraphPad Prism 8.1.2.
Per de materials suplementaris per aqueste article, mercés de consultar http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
S'agís d'un article d'accès dobèrt distribuit jos las condicions de la licéncia d'atribucion non comerciala Creative Commons , que permet l'usatge, la distribucion e la reproduccion dins quin mèdia que siá, tant que l'usatge final es pas per un profièch comercial e que la premissa es que l'òbra originala es corrècta. Referéncia.
Nòta : Vos demandam pas que de provesir vòstra adreça de corrièl per que la persona que recomandatz a la pagina sàpia que volètz que veja lo corrièl e qu'es pas de spam. Capturarem pas cap d'adreça de corrièl.
Aquesta question es utilizada per testar se sètz un visitor e evitar la somission automatica de spam.
Per E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analisi proteomica de las neurònas disfoncionalas revelèt que los programas metabolics son activats per contrarotlar la neurodegeneracion.
Per E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analisi proteomica de las neurònas disfoncionalas revelèt que los programas metabolics son activats per contrarotlar la neurodegeneracion.
©2020 Associacion Americana per l'Avançament de la Sciéncia. totes los dreches reservats. AAAS es un socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.