Actuala†Adreça actuala: OX11 0DE, Reialme Unit, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Reialme Unit, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Lo centre de reaccion complèxe de culhida de lutz 1 (RC-LH1) es lo compausant fotosintetic de basa de las bacterias fototròfas violetas. Introdusiguèrem doas estructuras de microscopia crioelectronica del complèxe RC-LH1 de Rhodopseudomonas palustris. L'estructura de resolucion de 2,65-Å del complèxe RC-LH114-W consistís en 14 bucles de sosunitat LH1 a l'entorn de RC, qu'es interromput per la proteïna W, del temps que lo complèxe sens proteïna-W es completament de composicion RC enrodat de RC. Bucle LH1 de 16 sosunitats barrat. La comparason d'aquelas estructuras provesís d'apercebuts sus la dinamica de la quinona dins lo complèxe RC-LH1, inclusent de cambiaments conformacionals prealablament indeterminats al moment de la ligason de la quinona al site RC QB, e tanben l'emplaçament dels sites de ligason de quinona auxiliars, qu'ajudan a los passar a RC. L'estructura unica de la proteïna W empacha la barradura del bucle LH1, creant aital un canal per accelerar l'escambi quinona/quinolona.
L'energia provesida per la fotosintèsi pòt sostenir gaireben tota la vida sus tèrra, e a un grand potencial per la biotecnologia solara. Del temps que promòvon la fotosintèsi globala, los bactèris fototròfs violets mòstran tanben divèrses mòdes d'energia e de capacitats metabolicas. Pòdon evitar la fotosintèsi e créisser coma de bactèris eterotròfs dins l'escur, pòdon fixar l'azòt e lo dioxid de carbòni, produire d'idrogèn, e degradar de compausats aromatics (1-3). Per provesir d'energia per aqueles processus, la lutz deu èsser rapidament e eficaçament convertida en energia quimica. Aqueste procès comença quand lo complèxe d'antena de trapa de la lutz absorbís la lutz e transferís l'energia atrapada al centre de reaccion (RC), començant aital la separacion de carga (4 – 7). L'unitat de basa de fotosintèsi dins los bactèris fototròfs violets es compausada de RC de tipe 2, enrodada del complèxe de culhida de lutz 1 (LH1), formant lo complèxe de còr RC-LH1. LH1 es format per un array d'eterodimèrs αβ corbats, que cadun liga doas moleculas de clorofila bacteriana (BChl) a e un o dos carotenoïdes (8-12). L'antena LH1 mai simpla consistís en 16 o 17 eterodimèrs αβ qu'entornan RC (9-13) dins un bucle barrat, mas dins d'autres complèxes de nuclèu, los peptides transmembranics interrompen la continuitat de l'LH1 a l'entorn, en promòvent aital la difusion quinol/quinòna entre RC e lo complèxe citocròme bc (1115). La planta fototròfica porpra Rhodopseudomonas (Rps.) es un organisme modèl que pòt comprene l'energia e lo transferiment d'electrons que sosten la fotosintèsi. La primera estructura cristalina de Rps. Lo modèl del complèxe palustris RC-LH1 es RC, enrodat de 15 bucles LH1 eterodimèrics, que son interromputs per una proteïna desconeguda nomenada "Proteïna W" (14). La proteïna-W foguèt posteriorament identificada coma RPA4402, qu'es una proteïna de 10,5kDa non caracterizada amb tres èlices transmembranas previstas (TMH) (16). Prepausam de renomenar lo gèn rpa4402 que codifica la proteïna W en pufW per èsser coerent amb la nomenclatura utilizada pels gèns que codifican las sosunitats RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB). Curiosament, la proteïna-W es solament presenta dins aperaquí 10% de RC-LH1, revelant Rps. palustris produtz dos complèxes RC-LH1 diferents. Aquí, raportam las estructuras de crio-EM (cryo-EM) de nauta resolucion de dos complèxes de còr, un amb proteïna W e 14 eterodimèrs αβ, l'autre sens proteïna W e un bucle LH1 de 16 heterodimèrs barrat. Nòstra estructura representa un cambiament de pas dins la compreneson del complèxe RC-LH1 de Rps. palustris, perque avèm analizat la populacion omogèna de cada varianta e avèm una resolucion sufisenta per assignar clarament cada peptid e de pigments ligats e de lipids e de quinònas ligats. La comparason d'aquelas estructuras mòstra que las tres proteïnas TMH-W que son pas estadas trobadas dins cap d'autre complèxe RC-LH1 fins ara generan un canal de quinona per accelerar l'escambi quinona/quinolona. Un fum de sites de ligason de lipids e de quinonas conservats son estats identificats, e avèm revelat un novèl cambiament conformacional après la combinason de quinona e RC, que pòt èsser adaptat pel fotosistèma II (PSII) RC d'organismes fototròfs oxigenats. Nòstras descobèrtas provesisson de novèlas coneissenças sus la cinetica de la ligason e de l'escambi de quinona/quinolona dins lo complèxe de còr RC-LH1 de las bacterias fototròficas violetas.
Per fin de facilitar un estudi detalhat dels dos complèxes trobats dins Rps. palustris, isolam cada RC-LH1 per de metòdes bioquimics. Lo complèxe deficient de proteïna W (d'ara enlà nomenat ΔpufW) foguèt purificat de la soca sens lo gèn pufW (16), e sonque un complèxe RC-LH1 pòt èsser produch. Lo complèxe de proteïna W que conten es produch per una soca. La proteïna W d'aquela soca es modificada amb una etiqueta His 10x a son C-terminus, de sòrta que lo complèxe contenent de proteïna W pòsca èsser eficaçament combinat amb la màger part de la proteïna W mancanta en immobilizant lo metal. Lo complèxe es eficaçament separat (16) Cromatografia d'afinitat (IMAC).
Coma mostrat dins la Figura 1, los dos complèxes contenon un RC de tres sosunitats (RC-L, RC-M e RC-H) enrodat d'una antena LH1. L'estructura 2,80-A del complèxe mancant de proteïna-W mòstra 16 eterodimèrs αβ, formant un bucle LH1 barrat enrodant completament RC, nomenat en seguida lo complèxe RC-LH116. L'estructura de 2,65Å del complèxe contenent de proteïna-W a un LH1 de 14 eterodimèrs interromput per la proteïna-W, nomenat d'ara enlà coma RC-LH114-W.
(A e B) Representacion superficiala del compausat. (C e D) Pigments ligats exprimits en varas. (E e F) Los complèxes observats dempuèi la superfícia citoplasmatica an los peptides e las sosunitats LH1 representadas dins los dessenhs animats, e son numerotats dins lo sens orari dempuèi l'espaci proteïna-W [coerent amb la numeracion Rba. complèxe esphaeroïdes (13)]. Per LH1-α, la color de la sosunitat de proteïna es jauna; per LH1-β, la color de la sosunitat de proteïna es blava; per la proteïna-W, la proteïna es roja; per RC-H, es cian; per RC-L, es Naranja; per RC-M, magenta. Los cofactors son representats per de varas, lo verd representa las moleculas BChl e BPh a, lo violet representa los carotenoïdes, e lo jaune representa las moleculas UQ10. (G e H) Vista magnificada de l'espaci proteïna-W dins la region equivalenta del complèxe RC-LH114-W (G) e del complèxe RC-LH116 (H). Los cofactors son afichats jos la forma d'emplenatge d'espaci, la quinona quelata es afichada en blau. L'espaci proteïna-W es mes en evidéncia per una linha traçada blava dins (G), e los pichons traucs ont quinona/quinolòl se difusa sus l'anèl LH116 son restacats per una linha traçada negra dins (H).
La figura 1 (A e B) mòstra lo RC enrodat de matriças dobèrtas o barradas d'eterodimèrs LH1αβ, que cadun liga dos BChl e un carotenoïde (Figura 1, C e D). D'estudis precedents an mostrat que Rps es lo complèxe LH1. Dins la via biosintetica de la xantina de l'espirulina, aquelas espècias contenon de populacions mixtas de carotenoïdes (17). Pasmens, l'espiropirroxantina es lo carotenoïde dominant e sa densitat es satisfasenta. Doncas, causiguèrem de modelizar l'espiroxantina a totes los sites de ligason LH1. Los polipeptids alfa e beta son de TMHs simples amb de regions exterioras de membrana cortas (Figura 1, A, B, E, e F). E mai se la densitat de 17 residus al C-terminus foguèt pas observada, lo polipeptid alfa foguèt fendut de Met1 a Ala46 dins los dos complèxes. Lo polipeptid β foguèt redusit de Gly4 a Tyr52 dins RC-LH116, e de Ser5 a Tyr52 dins RC-LH114-W. Cap de densitat de 3 o 4 residus N-terminal o 13 C-terminal foguèt observada (Figura S1). L'analisi d'espectrometria de massa del complèxe RC-LH1 mesclat preparat a partir de la soca de tipe salvatge mostrèt que la region mancanta èra lo resultat d'una scission eteròloga d'aqueles peptids (Figura S1 e S2). La formilacion N-terminala d'α-Met1 foguèt tanben observada (f). L'analisi mostrèt que lo α-peptide consistís en residus fMet1 a Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, e lo β-peptide consistís en residus Ser2 a Ala53, çò qu'es en bon acòrdi amb la mapa de densitat EM a bassa temperatura.
La coordinacion d'α-His29 e β-His36 fa BChls cara a cara; cada eterodimèr αβ s'assembla amb sos vesins per formar un bucle dobèrt (RC-LH114-W) o un bucle barrat (RC-LH116) a l'entorn del RC La matriça de pigments acoblats a l'exciton (Figura 1, C e D). Comparat amb la banda de 877 nm de RC-LH114-W, lo desplaçament roge d'absorpcion de 880 nm de RC-LH116 es de 3 nm (Figura 2A). Pasmens, l'espèctre del dicroïsme circular es gaireben lo meteis (Figura 2B), çò qu'indica que malgrat que i a una diferéncia clara entre los bucles dobèrts e barrats, l'environament local de BChls es fòrça similar. Lo desplaçament roge d'absorpcion pòt èsser lo resultat d'un movement termic redusit e d'una estabilitat aumentada sus la bocla barrada (18, 19), lo cambiament d'acoblament de pigment causat per la bocla barrada (20, 21), o una combinason d'aqueles dos efièches (11).
(A) Espèctre d'absorpcion ultravioleta/visible/prèp-infraroge, que los pics son marcats amb lors pigments correspondents e normalizats al pic BPh a 775 nm. (B) Espèctre de dicroïsme circular normalizat a l'absorbància BChl a 805 nm. (C e D) Espectres ΔA seleccionats dels espectres d'absorpcion resoluts en temps del complèxe RC-LH114-W (C) e del complèxe RC-LH116 (D). Per una melhora comparabilitat, totes los espectres son normalizats a ∆A de −A a 0,2 ps. (E) Lo taus d'oxidacion del citocròm c2 après irradiacion en preséncia de divèrsas concentracions d'UQ2 (veire la Figura S8 per de donadas brutas). (F) Dins de cellulas cultivadas jos una lutz d'intensitat bassa, mejana o nauta (10, 30 o 300μMm-2 s-1, respectivament), las sosunitats de proteïna W e RC-L dins lo complèxe purificat e lo rapòrt de membrana separada. Determinar lo nivèl de proteïna per l'electroforèsi en gel de poliacrilamida SDS e l'immunoassaig (veire la figura S9 per de donadas brutas). Determinatz lo rapòrt relatiu al complèxe RC-LH114-W purificat. Lo rapòrt estequiometric de RC-L a proteïna-W del complèxe es 1:1.
Los BChls a la posicion 1 dins lo bucle αβ14 deformat de RC-LH114-W (Figura 1, A, C, e E) son mai pròches del donaire primari RC (P) de 6,8Å que los BChls equivalents dins RC-LH116 (Figura. 1, B, D, e F, e S3); pasmens, la cinetica d'absorpcion transitòria dels dos complèxes mòstra que per RC-LH114-W e RC-LH116, las constantas de temps de transferéncia d'energia d'excitacion de LH1 a RC son de 40 ±4 e 44±3 ps (Figura 2). , C e D, Figura S4 e Taula S2). I a pas tanpauc de diferéncia significativa dins lo transferiment electronic dins RC (Figura S5 e tèxte suplementari ligat). Sospècham que la correspondéncia estrecha del temps de transferiment d'energia entre LH1 e RC-P es deguda a la distància, l'angle e l'energia potenciala similaras de la màger part de BChl dins los dos bucles LH1. Sembla qu'explorar lo modèl d'energia LH1 per aténher la distància minimala es pas mai rapid que lo transferiment d'energia dirècte de sites suboptimals a RC. Lo bucle LH1 de bucle dobèrt dins RC-LH114-W pòt tanben patir un movement termic insignificant dins de condicions de temperatura bassa per l'analisi estructurala, e i a una conformacion d'anèl αβ14 mai longa a temperatura ambienta a partir de la distància de pigmentacion de βBChls a la posicion de RC 1.
Lo complèxe RC-LH116 conten 32 BChls e 16 carotenoïdes, e son disposicion globala es la meteissa qu'aquela obtenguda de Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB (PDB) soca DB070 (PDB) (1979) e d'algas verdas (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Après alinhament, sonque de pichonas desviacions dins las posicions dels eterodimèrs αβ foguèron observadas, mai que mai 1-5, 15, e 16 (Figura S6). La preséncia de proteïna-W a un impacte significatiu sus l'estructura de LH1. Sos tres TMH son connectats per de bucles corts, amb lo N-terminal del costat del lumen del complèxe e lo C-terminal del costat citoplasmatic (Figuras 1A e 3, A a D). La proteïna-W es largament idrofòba (Figura 3B), e TMH2 e TMH3 interagisson amb LH1αβ-14 per formar una superfícia transmembrana (Figura 3, B e E a G). L'interfàcia es subretot compausada de residus Phe, Leu e Val dins la region transmembrana. Aquestes residus son empilhats amb d'acids aminats idrofòbs e de pigments αβ-14. Qualques residus polars contribuisson tanben a l'interaccion, inclusent lo ligam d'idrogèn entre W-Thr68 e β-Trp42 sus la superfícia de la cavitat complèxa (Figura 3, F e G). Sus la superfícia del citoplasma, Gln34 es adjacent al grop ceto dels carotenoïdes αβ-14. De mai, la molecula n-dodecil β-d-maltosida (β-DDM) foguèt resolguda, e sa coa idrofòba s'espandiguèt a l'interfàcia entre proteïna-W e αβ-14, e la coa lipida pòt èsser situada dins lo còrs. Avèm tanben remarcat que las regions de resolucion C-terminala de la proteïna W e RCH son fòrça pròchas, mas pas dins l'encastre de la formacion d'interaccions especificas (Figura 1, A e E). Pasmens, pòt i aver d'interaccions dins los aminoacids C-terminals non resoluts d'aquelas doas proteïnas, çò que pòt provesir un mecanisme pel recrutament de la proteïna-W pendent l'assemblatge del complèxe RC-LH114-W.
(A) La proteïna-W, qu'afronta l'interfàcia amb LH1αβ14 en forma de dessenh animat, a una cadena laterala en forma de vara (roge), afichada dins una partida del diagrama de potencial electrostatic (superfícia grisa transparenta amb un nivèl de contorn de 0,13). (B) Proteïna-W representada per una superfícia colorada idrofòba. Las zònas polaras e cargadas son afichadas en cian, las zònas idrofòbas son afichadas en blanc, e las zònas fòrtament idrofòbas son afichadas en irange. (C e D) Proteïna-W representada dins lo dessenh animat, son orientacion es la meteissa que dins (A) (C), e virada de 180° (D). Segon la posicion dins la sequéncia, los residus distinguibles adoptan un esquema de colors arc de sèt, ont lo N-terminal es blau e lo C-terminal es roge. (E) Proteïna-W dins la meteissa vista que dins (A), e los residus a l'interfàcia de proteïna-W:LH1 son representats per de barras amb de marcas jonchas. (F) La proteïna-W es rotada de 90° per rapòrt a (E) e LH1αβ14 dins la representacion del dessenh animat, e per rapòrt als residus d'interfàcia dins la representacion de la barra. Los residus suspendents del polipeptid beta son etiquetats. Lo cofactor es mostrat coma una barra correspondent a la color de la Figura 1, lo β-DDM descompausat es mostrat en gris, e l'oxigèn es mostrat en roge. (G) La vista dins (F) es virada de 180°, amb los residus proeminents del polipeptid alfa marcat.
La proteïna-W remplaça un eterodimèr αβ (lo 15en dins la Figura 1F), en empachant aital la barradura del bucle e en basculant los tres primièrs eterodimèrs αβ. S'observèt que l'angle d'inclinason maximal del primièr eterodimèr αβ-1 en rapòrt amb la pellicula normala èra de 25° a 29° (Figura 1, A e E), que foguèt format per l'inclinason de 2° a 8° d'αβ-1 dins RC A de contraste agut-LH116 (Figura 1, B e F). Los segond e tresen eterodimèrs son inclinats de 12° a 22° e de 5° a 10°, respectivament. A causa de l'empacha esterica de RC, l'inclinason d'αβ-1 inclutz pas lo segond parelh d'αβ (que correspond al 16n αβ dins la Figura 1F), formant aital un espaci clar dins l'anèl LH1 (Figura 1, A e E) . A causa de la manca de dos eterodimèrs αβ, acompanhats de la pèrda de quatre BChl e dos carotenoïdes, cap dels carotenoïdes se liga pas a la sosunitat αβ-1 torçada, çò que resulta en un anèl LH114-W que conten 13 carotenoïdes Vegetarians e 28 BChls. Las estimacions de resolucion locala dels dos complèxes dins las regions αβ1 a 7 son mai bassas qu'aquelas del rèsta del bucle LH1, çò que pòt reflectir la plasticitat inerenta de la sosunitat LH1 adjacenta al site RC QB (Figura 4) .
Las imatges de RC-LH114-W (A e B) e RC-LH116 (C e D) son mostradas dempuèi la meteissa vista superiora/vista laterala (A e B) (A e C) e superfícia de cavitat de la Fig. 1. (B e D). Las tòcas coloradas son afichadas a drecha.
Lo sol autre complèxe de còr caracteristic amb un rapòrt estequiometric de 1:14 es lo dimèr Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Pasmens, la proteïna W e PufX an pas d'omologia evidenta, e an un impacte significatiu sus lors estructuras LH1 respectivas. PufX es un TMH unic amb un domeni citoplasmatic N-terminal qu'interagís amb lo costat citoplasmatic de la sosunitat RC-H (13) a una posicion correspondenta a Rps. palustris LH116αβ-16. PufX crea un canal per l'escambi quinona/quinolona entre RC-LH1 e lo complèxe citocròm bcl e es present dins totes los Rba. complèxe de nuclèu esphaeroïdes (13). E mai se l'interfàcia monomèr-monomèr es en Rba. Lo dimèr sphaeroides RC-LH1-PufX es situat a la posicion de ligason de la proteïna W dins RC-LH114-W, e l'espaci induch per PufX e la proteïna-W es a una posicion equivalenta (Figura S7A). L'espaci dins RC-LH114-W es tanben alinhat amb lo canal ipotetic de quinona (8) de Pseudomonas rosea LH1, qu'es format per de peptides pas ligats a la proteïna W o PufX (Figura S7B). Además, la canal de quinona en Blc. Lo LH1 verd esmeralda format en exclusent una sosunitat γ (7) es situat dins una posicion similara (Figura S7C). E mai se mediat per diferentas proteïnas, l'aparicion d'aqueles canals de quinona/quinolol dins una posicion comuna dins lo complèxe RC-LH1 sembla èsser un exemple d'evolucion convergenta, çò qu'indica que l'espaci creat per la proteïna W pòt agir coma un canal de quinona.
L'espaci dins lo bucle LH114-W permet la formacion d'una region de membrana continua entre l'espaci intèrne del complèxe RC-LH114-W e la membrana en massa (Figura 1G), puslèu que de connectar los dos domenis a travèrs un pòr de proteïna coma dins las proteïnas. Lo complèxe RC-LH116 es similar a un Tch barrat. Complèxe en forma d'agulha (22) (Figura 1H). Coma la difusion de quinona a travèrs la membrana es mai rapida que la difusion a travèrs lo canal de proteïna estrech, lo bucle LH114-W dobèrt pòt permetre un rotacion RC mai rapida que lo bucle LH116 barrat, e la difusion de quinona dins lo RC pòt èsser mai restrencha. Per tal de testar se la proteïna W afecta la conversion de quinònas a travèrs RC, faguèrem un ensag d'oxidacion de citocròm sus una cèrta concentracion d'ubiquinona 2 (UQ2) (un analòg de l'UQ10 natural amb una coa d'isoprèn mai corta) (Figura 2E). E mai se la preséncia de quinona quelada empacha la determinacion precisa de la constanta Michaelis aparenta (RC-LH114-W e RC-LH116 son adaptats per 0,2±0,1μM e 0,5±0,2μM, respectivament), lo taus maximal de RC-LH114-W ( 4,6±0,20,20,2μM) es-e-s. 28±5% mai grand que RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Estimèrem inicialament que la proteïna-W es presenta dins aperaquí 10% del complèxe de còr (16); aquí, los tausses d'ocupacion de las cellulas de creissença de lutz bassa, de lutz mejana e de lutz nauta son de 15±0,6%, 11±1% e 0,9±0,5, respectivament % (Figura 2F). La comparason quantitativa de l'espectrometria de massa mostrèt que l'addicion d'etiqueta d'istidina redusiguèt pas l'abondància relativa de proteïna-W comparada a de socas de tipe salvatge (P = 0,59), doncas aqueles nivèls son pas un artefacte de proteïna-W modificada (Figura S10). Pasmens, aquela bassa ocupacion de proteïna-W dins lo complèxe RC-LH1 pòt permetre a qualques RCs de virar a un ritme accelerat, mitigant aital l'escambi quinona/quinolona mai lent dins lo complèxe RC-LH116. Avèm remarcat que lo taus d'ocupacion de lutz naut es incoerent amb las donadas recentas de transcriptomica, çò qu'indica que l'expression del gèn pufW aumenta jos una lutz fòrta (Figura S11) (23). La diferéncia entre la transcripcion pufW e l'incorporacion de la proteïna-W dins lo complèxe RC-LH1 es confusa e pòt reflectir la regulacion complèxa de la proteïna.
Dins RC-LH114-W, 6 cardiolipina (CDL), 7 fosfatidilcolina (POPC), 1 fosfatidilgliceròl (POPG) e 29 moleculas β-DDM son assignadas e modeladas en el 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs e 22βDs. RC-LH116 (Figura 5, A e B). Dins aquelas doas estructuras, CDL es gaireben situat sul costat citoplasmatic del complèxe, del temps que POPC, POPG e β-DDM son subretot situats sul costat luminal. Doas moleculas de lipid e de detergent foguèron isoladas dins la region αβ-1 a αβ-6 del complèxe RC-LH114-W (Figura 5A), e cinc foguèron isoladas dins la region equivalenta de RC-LH116 (Figura 5B). Mai de lipids foguèron trobats de l'autre costat del complèxe, subretot CDL, acumulats entre RC e αβ-7 a αβ-13 (Figura 5, A e B). D'autres lipids e detergents estructuralament resoluts son situats en defòra de l'anèl LH1, e de cadenas acilas plan resoludas s'estendon entre de sosunitats LH1, designadas tentativament coma β-DDM dins RC-LH114-W, e definidas coma β-DDM dins RC A una mescla de β-DDM e PO-LH16-LH16. Las posicions similaras dels lipids quelants e dels detergents dins nòstra estructura indican que son de sites de ligason fisiologicament pertinents (Figura S12A). Las posicions de las moleculas equivalentas dins Tch an tanben una bona consisténcia. Gentil e Trv. La soca 970 RC-LH1s (Figura S12, B a E) (9, 12) e los residus de ligam idrogèn del grop de cap lipid mostrèron una pro bona conservacion dins l'alinhament de la sequéncia (Figura S13), çò qu'indica que CDL conservat que se liga a RC (24), aqueles sites pòdon èsser conservats dins lo complèxe RCH-LH1.
(A e B) Los peptides RC-LH114-W (A) e RC-LH116 (B) son representats per de dessenhs animats, e los pigments son representats per de barras, en utilizant l'esquèma de colors de la Figura 1. Los lipids son mostrats en roge, e los detergents son mostrats en gris. L'UQ ligat als sites RC QA e QB es jaune, del temps que l'UQ isolat es blau. (C e D) Las meteissas vistas que (A) e (B), amb de lipids omeses. (E a G) Vista agrandida de Q1(E), Q2(F) e Q3(G) de RC-LH116, amb de cadenas lateralas qu'influéncian l'una l'autra. Los ligams d'idrogèn son mostrats coma de linhas traçadas negras.
Dins RC-LH116, tant RC QA coma QB UQ, que participan al transferiment d'electrons dins lo procès de separacion de carga, son descompausats dins lors sites de ligason. Pasmens, dins RC-LH114-W, la quinona QB es pas estada resoluda e serà discutida en detalh çai-jos. En mai de las quinònas QA e QB, doas moleculas UQ queladas (situadas entre los anèls RC e LH1) son assignadas dins l'estructura RC-LH114-W segon lors grops de cap plan resoluts (situats dins Q1 e Q2, respectivament). espaci). Figura 5C). Doas unitats d'isoprèn son assignadas a Q1, e la mapa de densitat resòlv las 10 coas d'isoprèn completas de Q2. Dins l'estructura de RC-LH116, tres moleculas UQ10 queladas (Q1 a Q3, Figura 5D) foguèron resoludas, e totas las moleculas an una densitat clara dins tota la coa (Figura 5, D a G). Dins las doas estructuras, las posicions dels grops de cap de quinona de Q1 e Q2 an una consisténcia excelenta (Figura S12F), e interagisson pas qu'amb RC. Q1 es situat a l'intrada de l'espaci W de RC-LH114-W (Figura 1G e 5, C, D e E), e Q2 es situat prèp del site de ligason QB (Figura 5, C, D) e F). Los residus L-Trp143 e L-Trp269 conservats son fòrça pròches de Q1 e Q2 e provesisson d'interaccions potencialas d'empilatge π (Figura 5, E e F, e Figura S12). L-Gln88, 3,0 Å de l'oxigèn distal de Q1, provesís un ligam d'idrogèn fòrt (Figura 5E); aquel residu es conservat dins totes los RC levat la relacion mai luènha (Figura S13). L-Ser91 es substituit de manièra conservatritz per Thr dins la màger part dels autres RC (Figura S13), es a 3,8 Angstroms de l'oxigèn metil de Q1, e pòt provesir de ligams d'idrogèn febles (Figura 5E). Q3 sembla pas aver una interaccion especifica, mas es situat dins la region idrofòba entre la sosunitat RC-M e la sosunitat LH1-α 5 a 6 (Figura 5, D e G). Q1, Q2 e Q3 o de quinònas queladas pròchas son tanben estadas resoludas dins Tch. Doç, Trv. Soca 970 e Blc. L'estructura de l'iris (9, 10, 12) punta cap a un site de ligason de quinona auxiliar conservat dins lo complèxe RC-LH1 (Figura S12G). Los cinc UQs descompausats dins RC-LH116 son en bon acòrdi amb lo 5,8±0,7 de cada complèxe determinat per la cromatografia liquida de nauta performància (HPLC), del temps que los tres UQs descompausats dins RC-LH114-W son inferiors a La valor mesurada de 6,2±0,3 (Fig. S14) indica que i a pas de moleculas UQ resolgudas. estructura.
Los polipeptides L e M pseudosimetrics contenon cadun cinc TMHs e forman un eterodimèr que combina un dimèr BChl, dos monomèrs BChl, dos monomèrs de bacteriofags (BPh), e un fèrre non Heme e una o doas moleculas UQ10. A travèrs la preséncia de ligams d'idrogèn sul grop de cetona terminala e son acumulacion coneguda en Rps, los carotenoïdes son incorporats dins la subunitat M, que se nomena cis-3,4-dehidroorhodopina. Espècia (25). Lo domeni de la membrana exteriora de RC-H es ancorat a la membrana per un sol TMH. L'estructura globala RC es similara a las tres sosunitats RC d'espècias ligadas (coma Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Los macrocicles de BChl e BPh, l'espina carotenoïda e lo fèrre non-ème se superpausan dins la gama de resolucion d'aquelas estructuras, coma o fan lo grop de cap UQ10 al site QA e la quinona QB a RC-LH116 (Figura S15).
La disponibilitat de doas estructuras RC amb de tausses d'ocupacion del site QB diferents provesís una novèla escasença d'examinar los cambiaments conformacionals coerents qu'acompanhan la ligason de quinona QB. Dins lo complèxe RC-LH116, la quinona QB es situada dins la posicion "proximala" completament ligada (26), mas la separacion de RC-LH114-W a pas de quinona QB. I a pas de quinona QB dins RC-LH114-W, çò qu'es estonant perque lo complèxe es actiu, mai que lo complèxe RC-LH116 amb de quinona QB estructuralament resoluda. E mai se los dos anèls LH1 quelan aperaquí sièis quinònas, cinc son estructuralament resoluts dins l'anèl RC-LH116 barrat, del temps que sonque tres son estructuralament limitats dins l'anèl RC-LH114-W dobèrt. Aqueste desòrdre estructural aumentat pòt reflectir lo remplaçament mai rapid dels sites QB RC-LH114-W, una cinetica de quinona mai rapida dins lo complèxe, e una probabilitat aumentada de traversar lo bucle LH1. Suggerissèm que la manca d'UQ dins lo site RC QB de RC-LH114-W pòt èsser lo resultat d'un complèxe mai complèxe e mai actiu, e lo site QB de RC-LH114-W es estat immediatament gelat dins la rotacion UQ L'estadi especific (l'intrada al site QB es estada barrada) reflècha la conformacion d'aquela activitat.
Sens QB, la rotacion acompanhanta de L-Phe217 cap a una posicion qu'es incompatibla amb la ligason UQ10, perque causarà una collision espaciala amb la primièra unitat d'isoprèn de la coa (Figura 6A). De mai, los cambiaments conformacionals principals evidents son evidents, mai que mai l'èlica de (èlica corta dins lo bucle entre TMH D e E) ont L-Phe217 es desplaçat cap a la pòcha de ligason QB e la rotacion de L-Tyr223 (Figura 6A ) Per trencar lo ligam d'idrogèn amb l'encastre M-Ap5 e barrar l'intrada de ligason QB site (Figura 6B). L'èlica pivota a sa basa, lo Cα de L-Ser209 es desplaçat de 0,33Å, del temps que lo L-Val221Cα es desplaçat de 3,52Å. I a pas de cambiaments observables dins TMH D e E, que son superpausables dins las doas estructuras (Figura 6A). Per çò que sabèm, aquò's la primièra estructura dins lo RC natural que barra lo site QB. Una comparason amb l'estructura completa (ligada a QB) mòstra qu'abans que la quinona siá redusida, un cambiament de conformacion es necessari per la far dintrar dins la quinona. L-Phe217 vira per formar una interaccion π-empilament amb lo grop de cap de quinona, e l'èlica se desplaça cap a l'exterior, permetent a l'esqueleta de L-Gly222 e a la cadena laterala de L-Tyr223 de formar un ret de ligams d'idrogèn amb una estructura de ligams d'idrogèn establa (Figura 6, A e C).
(A) Dessin animat superpausat d'olograma (cadena L, cadena irange/M, magenta) e d'estructura apo (gris), que los residus claus son afichats jos la forma d'una representacion en forma de vara. UQ10 es representat per una barra jauna. La linha puntejada indica los ligams d'idrogèn formats dins l'estructura entièra. (B e C) La representacion de superfícia de l'apolipoproteïna e de l'estructura entièra de l'anèl, en soslinhant l'oxigèn de la cadena laterala de L-Phe217 en blau e L-Tyr223 en roge, respectivament. La subunitat L es irange; las sosunitats M e H son pas coloradas. (D e E) Apolipoproteïna (D) e entièr (E) RC QB sites [color per (A) respectivament] e Thermophilus thermophilus PSII (verd, blau amb quinòna plastica; PDB ID: 3WU2) Align (58).
De manièra inesperada, e mai se divèrsas estructuras de RCs deficients en QB sens LH1 son disponiblas, los cambiaments conformacionals observats dins aqueste estudi son pas estats raportats prèviament. Aquestes incluson l'estructura d'esgotament QB de Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) e Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), que son totes gaireben los meteisses que lor estructura QB globala. Una inspeccion pròcha de 3PRC revelèt que las moleculas de detergent LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) se ligan a l'intrada de la posicion QB, çò que pòt empachar lo reorganizament dins una conformacion barrada. E mai se LDAO se descompausa pas a la meteissa posicion dins 1EYS o 1OGV, aqueles RC son preparats en utilizant lo meteis detergent e pòdon doncas produire lo meteis efièch. L'estructura cristallina de Rba. Sphaeroides RC cocristallizat amb lo citocròm c2 (PDB ID: 1L9B) sembla tanben aver un site QB barrat. Pasmens, dins aquel cas, la region N-terminala del polipeptid RC-M (interagissent amb lo site de ligason QB a travèrs lo ligam H del residu Tyr sus l'èlica Q) adopta una conformacion antinaturala, e lo cambiament de conformacion QB es pas mai explorat (30 ). Çò qu'es rassegurant es qu'avèm pas vist aquel tipe de deformacion del polipeptid M dins l'estructura RC-LH114-W, qu'es gaireben la meteissa que la region N-terminala de RC-LH116 RC. Cal tanben notar qu'après l'eradicacion de l'antena LH1 basada sus de detergent, los RCs d'apolipoproteïnas dins lo PDB foguèron resoluts, çò qu'eliminèt los pòls de quinona intèrnes e los lipids dins l'espaci entre lo RC e la superfícia intèrna de l'anèl LH1 a l'entorn (31, 32). RC demòra foncional perque conserva totes los cofactors, levat la quinona QB descompausabla, qu'es mens establa e se pèrd sovent pendent lo procès de preparacion (33). De mai, se sap que l'eliminacion de LH1 e de lipids ciclics naturals de RC pòt aver un impacte sus las foncions, coma la durada de vida acorchida de l'estat P+QB separat per carga (31, 34, 35). Doncas, especulam que l'existéncia de l'anèl LH1 local a l'entorn del RC pòt manténer lo site QB "tancat", en preservant aital l'environament local prèp del QB.
E mai se l'apolipoproteïna (sens quinona QB) e l'estructura completa representan pas que doas instantanèas del rotacion del site QB, puslèu qu'una tièra d'eveniments, i a d'indicacions que la ligason pòt èsser barrada per prevenir la reconligacion per l'idroquinona Per inhibir l'inibicion del substrat. L'interaccion de quinolol e de quinona còsta lo site QB de l'apolipoproteïna pòt èsser diferenta, çò que mena a son refús per RC. Es estat dempuèi longtemps prepausat que los cambiaments conformacionals jògan un ròtle dins la ligason e la reduccion de las quinònas. La capacitat dels RCs congelats a reduire las quinònas après l'adaptacion escura es alterada (36); La cristalografia de rais X mòstra qu'aqueste damatge es degut a la quinòna QB essent atrapada dins una conformacion "distala" aperaquí 4,5 Å de la posicion proximala activa (26) , 37). Suggerissèm qu'aquela conformacion de ligason distala es un instantanèu de l'estat intermediari entre l'apolipoproteïna e l'estructura de l'anèl complet, que seguís l'interaccion iniciala amb la quinona e la dobertura del site QB.
Lo RC de tipe II trobat dins lo complèxe PSII de cèrtas bacterias fototròficas e cianobactèris, algas e plantas a una conservacion estructurala e foncionala (38). L'alinhament estructural mostrat dins la Figura 6 (D e E) met l'accent sus la similitud entre los RC PSII e lo site QB del complèxe RC bacterian. Aquesta comparason es estada dempuèi longtemps un modèl per estudiar los sistèmas estrechament ligats de ligason e reduccion de quinona. De publicacions precedentas suggeriguèron que los cambiaments conformacionals son acompanhats de reduccion PSII de las quinònas (39, 40). Doncas, en considerant la conservacion evolutiva de RC, aquel mecanisme de ligason non observat abans pòt tanben èsser aplicable al site QB de PSII RC dins de plantas fototròficas oxigenadas.
Rps ΔpufW (supression pufW non marcada) e PufW-His (proteïna-W marcada amb His 10x C-terminal exprimida dempuèi lo locus pufW natural). palustris CGA009 foguèt descrich dins nòstre trabalh precedent (16). Aquelas socas e lo parent isogènic de tipe salvatge foguèron recuperats del congelador en raiant un pichon nombre de cellulas sus PYE (cadun 5 g litre -1) (emmagazinats dins LB a -80 °C, contenent 50% ( p/v) de gliceròl) de proteïna, d'extrach de levat e d'agar de succinat [1,5% (p/v)) de la placa. La placa foguèt incubada tota la nuèch dins l'escur a temperatura ambienta dins de condicions anaerobias, e puèi esclairada amb de lutz blanca (~50 μmolm-2 s-1) provesida per d'ampolas alogènas OSRAM 116-W (RS Components, UK) pendent 3 a 5 jorns fins qu'una sola colonia apareguèsse. Una sola colonia foguèt utilizada per inocular 10 ml de mitan M22+ (41) complementat amb 0,1% (p/v) d'acids casamino (en seguida nomenat M22). La cultura foguèt cultivada dins de condicions d'oxigèn bas dins l'escur a 34°C amb un tremolament a 180 rpm pendent 48 oras, e puèi 70 ml de la cultura foguèt inoculada dins las meteissas condicions pendent 24 oras. Una cultura semi-aerobica d'un volum de 1 ml es utilizada per inocular 30 ml de mitan M22 dins una botelha de veire transparent universala de 30 ml e irradiada amb agitacion (~50μmolm-2 s-1) pendent 48 oras per una fòrça magnetica esterila. Puèi 30 ml de la cultura foguèron inoculats amb aperaquí 1 litre de cultura dins las meteissas condicions, que foguèt alara utilizat per inocular aperaquí 9 litres de cultura esclairada a ~200 μmolm-2 s-1 pendent 72 oras. Las cellulas foguèron culhidas per centrifugacion a 7132 RCF pendent 30 minutas, resuspendadas dins ~10 ml de 20 mM tris-HCl (pH 8,0), e emmagazinadas a -20°C fins a la necessitat.
Après descongelacion, apondètz qualques cristals de desoxirribonucleasa I (Merck, Reialme Unit), de lisozima (Merck, Reialme Unit) e doas pastilhas d'inibitor de la proteasa de l'oloenzima Roche (Merck, Reialme Unit) a las cellulas resuspendudas. Dins una cellula de pression francesa de 20 000 psi (Aminco, EUA), las cellulas foguèron perturbadas de 8 a 12 còps. Après aver levat de cellulas non trencadas e de degalhs insolubles per centrifugacion a 18 500 RCF pendent 15 minutas a 4°C, la membrana foguèt precipitada del lisat pigmentat per centrifugacion a 113 000 RCF pendent 2 oras a 43 000 °C. Escartar la fraccion solubla e tornar suspendre la membrana colorada dins 100 a 200 ml de 20 mM tris-HCl (pH 8,0) e omogeneizar fins que i aja pas d'agregats visibles. La membrana suspenuda foguèt incubada dins 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) contenent 2% (p/v) β-DDM pendent 1 ora dins l'escur a 4°C amb un agitacion doça. Puèi centrifugar a 70°C per dissòlvre 150 000 RCF a 4°C pendent 1 ora per levar los insolubles residuals.
La membrana solubilizanta de la soca ΔpufW foguèt aplicada a una colomna d'escambi d'ions de sefaròsa DEAE de 50 ml amb tres volums de colomna (CV) de tampon de ligason [20 mM tris-HCl (pH 8,0) contenent 0,03% (p / v) β-DDM]. Lavar la colomna amb dos tampons de ligason CV, e puèi lavar la colomna amb dos tampons de ligason contenent 50 mM NaCl. Lo complèxe RC-LH116 foguèt eluit amb un gradient linear de 150 a 300 mM NaCl (en tampon de ligason) sus 1,75 CV, e lo complèxe de ligason restant foguèt eluit amb un tampon de ligason contenent 300 mM NaCl sus 0,5 CV. Reculhir l'espèctre d'absorpcion entre 250 e 1000 nm, gardar la fraccion amb un rapòrt d'absorpcion (A880/A280) mai grand que 1 a 880 a 280 nm, la diluir dos còps dins lo tampon de ligason, e utilizar lo meteis procediment tornarmai sus la colomna DEAE sus la purificacion. Diluir las fraccions amb de rapòrts A880/A280 superiors a 1,7 e de rapòrts A880/A805 superiors a 3,0, realizar la tresena ronda d'escambi d'ions, e conservar de fraccions amb de rapòrts A880/A280 superiors a 2,2 e de rapòrts A880/A805 superiors a 5,05. Lo complèxe parcialament purificat foguèt concentrat a ~2 ml dins un filtre centrifugal de talha de pes molecular Amicon 100 000 (MWCO) (Merck, Reialme Unit), e cargat sus una colomna d'exclusion de talha Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) contenent 200 mM de tampon de NaCl, puèi eluït dins lo meteis tampon al 15.000. CV. Reculhissètz los espectres d'absorpcion de la fraccion d'exclusion de talha, e concentratz los espectres d'absorpcion amb de rapòrts A880/A280 sus 2,4 e de rapòrts A880/A805 sus 5,8 a 100 A880, e los utilizatz immediatament per la preparacion o l'emmagazinatge de la grasilha crio-TEM Gardatz a -80°C fins que siá necessari.
La membrana solubilizanta de la soca PufW-His foguèt aplicada a una colomna de 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8,0) contenent 200 mM NaCl e 0,03% (p/p)) dins un tampon IMAC ( GE Healthcare). v) β-DDM]. La colomna foguèt lavada amb cinc CVs de tampon IMAC, e puèi amb cinc CVs de tampon IMAC contenent 10 mM d'istidina. Lo complèxe de còr foguèt eluit de la colomna amb cinc tampons IMAC que contenián 100 mM d'istidina. La fraccion que conten lo complèxe RC-LH114-W es concentrada a ~10 ml dins un tanc agitat equipat d'un filtre Amicon 100 000 MWCO (Merck, Reialme Unit), diluida 20 còps amb de tampon de ligason, e puèi aponduda a 25 ml Dins la colomna DEAE Sepharose, quatre tampons CV ligats al tampon b son utilizats abans. Lavar la colomna amb quatre tampons de ligason CV, puèi eluir lo complèxe sus uèch CVs sus un gradient linear de 0 a 100 mM NaCl (en tampon de ligason), e los quatre CVs restants contenent 100 mM de tampon de ligason Los complèxes residuals eluits sul clorur de sòdi combinats amb lo rapòrt A/880 A/288800 mai naut que 2004. Lo rapòrt A880/A805 mai naut que 4,6 de fraccions foguèron concentrats a ~2 ml dins un filtre centrifugal Amicon 100 000 MWCO, e emplenats amb 1,5 CV IMAC per avança amb un tampon equilibrat Superdex 200 16/600 colomna d'exclusion de talha, e puèi eluits dins lo meteis tampon sus 15 CV. Reculhitz los espectres d'absorpcion de las fraccions d'exclusion de talha e concentratz los espectres d'absorpcion amb de rapòrts A880/A280 sus 2,1 e de rapòrts A880/A805 sus 4,6 a 100 A880, que son immediatament utilizats per la preparacion de la grasilha TEM gelada o emmagazinats a -80°C fins al besonh.
Un congelador d'immersion Leica EM GP foguèt utilizat per preparar de grasilhas TEM a bassa temperatura. Lo complèxe foguèt diluit dins un tampon IMAC a A880 de 50, e puèi 5μl foguèt cargat sus una malha de coire recoberta de carbòni QUANTIFOIL 1.2/1.3 recentament descargada de lutz (Agar Scientific, Reialme Unit). Incubatz la grasilha a 20°C e 60% d'umiditat relativa pendent 30 s, puèi la borratz seca pendent 3 s, e puèi apagatz-la dins d'etan liquid a -176°C.
Las donadas del complèxe RC-LH114-W foguèron enregistradas sus l'eBIC (Centre Electronic Bioimaging) (British Diamond Light Source) amb un microscòpi Titan Krios, que fonciona a una tension d'acceleracion de 300kV, amb una amplificacion nominal de 130 000× e una energia d'un espaci Choo-se de 200V. Un Gatan 968 GIF Quantum amb detector de pic K2 foguèt utilizat per enregistrar d'imatges en mòde de compte per collectar de donadas. La talha de pixèl calibrat es de 1,048Å, e lo taus de dòsi es de 3,83 e-Å-2s-1. Reculhiguèri lo filme en 11 segondas e lo divisèri en 40 partidas. Utilizatz l'airal recobert de carbòni per tornar focalizar lo microscòpi, e puèi collectatz tres filmes per trauc. En total, 3130 filmes foguèron collectats, amb de valors de desfocalizacion entre -1 e -3μm.
Las donadas pel complèxe RC-LH116 foguèron collectadas en utilizant lo meteis microscòpi al Laboratòri de Bioestructura d'Asterbury (Universitat de Leeds, Reialme Unit). Las donadas foguèron collectadas en mòde de compte amb una amplificacion de 130 k, e la talha de pixèl foguèt calibrada a 1,065 Å amb una dòsi de 4,6 e-Å-2s-1. Lo filme foguèt enregistrat en 12 segondas e devesit en 48 partidas. En total, 3359 filmes foguèron collectats, amb de valors de desfocalizacion entre -1 e -3μm.
Tot lo tractament de donadas es realizat dins lo pipeline Relion 3.0 (42). Utilizatz Motioncorr 2 (43) per corregir lo movement del fais per ponderacion de dòsi, e puèi utilizatz CTFFIND 4.1 (44) per determinar lo paramètre CTF (foncion de transferiment de contraste). Las fotomicrografias tipicas après aquelas estapas de tractament inicialas son mostradas dins la Figura 2. S16. Lo modèl de seleccion automatica es generat en seleccionant manualament aperaquí 250 pixèls de 1000 particulas dins un encastre de 250 pixèls e sens classificacion bidimensionala (2D) de referéncia, refusant aital aquelas classificacions que respondon a la contaminacion de la mòstra o qu'an pas de caracteristicas discerniblas. Puèi, una seleccion automatica foguèt realizada sus totas las microfotografias, e lo RC-LH114-W èra de 849 359 particulas, e lo complèxe RC-LH116 èra de 476 547 particulas. Totas las particulas seleccionadas an subit dos torns de classificacion 2D non-referéncia, e après cada corsa, las particulas que rescontran l'airal de carbòni, la contaminacion de la mòstra, pas cap de caracteristicas evidentas o de particulas fòrtament superposadas son rebutadas, çò que resulta en 772 033 (90,9%) e 359 678 (75,5) de particulas de classificacion 3D son utilizadas per la classificacion 3D 3D. RC-LH114-W e RC-LH116 respectivament. Lo modèl de referéncia 3D inicial foguèt generat en utilizant lo metòde de davalada de gradient estocastic. En utilizant lo modèl inicial coma referéncia, las particulas seleccionadas son classadas en quatre categorias en 3D. En utilizant lo modèl d'aquesta categoria coma referéncia, realizatz un rafinament 3D sus las particulas de la categoria mai granda, puèi utilizatz lo filtre de passatge bas inicial de 15Å per cobrir l'airal del solvent, apondretz 6 pixèls de bòrds suaus, e post-tractatz los pixèls per corregir la foncion de transferiment de modulacion de pic Gatan K2 del detector superior. Per l'ensemble de donadas RC-LH114-W, aquel modèl inicial foguèt modificat en levant la fòrta densitat als bòrds de la masca (desconnectada de la densitat del complèxe de còr dins UCSF Quimera). Los modèls resultants (las resolucions de RC-LH114-W e RC-LH116 son de 3,91 e 4,16 Å, respectivament) son utilizats coma referéncia pel segond torn de classificacion 3D. Las particulas utilizadas son agropadas dins la classa 3D iniciala e contenon pas de fòrta correlacion amb lo vesinatge. Superposicion o manca de caracteristicas estructuralas evidentas. Après lo segond torn de classificacion 3D, la categoria amb la resolucion mai nauta foguèt seleccionada [Per RC-LH114-W, una categoria es 377 703 particulas (44,5%), per RC-LH116, i a doas categorias, en totalizant 260 752 particulas (54,7% W), quand son solament las meteissas après que son las meteissas. rotacion iniciala amb una pichona diferéncia]. Las particulas seleccionadas son reextrachas dins una bóstia de 400 pixèls e rafinadas per un rafinament 3D. La masca de solvent es generada en utilizant lo filtre pas bas inicial de 15Å, l'expansion de mapa de 3 pixèls e la masca doça de 3 pixèls. En utilizant lo rafinament CTF per particula, la correccion de movement per particula e lo segond torn de rafinament CTF per particula, lo rafinament 3D, lo mascatge del solvent e lo post-tractament son realizats après cada estapa per afinar mai la textura resultanta. En utilizant la valor de talh FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) de 0,143, las resolucions dels modèls finals de RC-LH114-W e RC-LH116 son de 2,65 e 2,80Å, respectivament. La corba FSC del modèl final es mostrada dins la Figura 2. S17.
Totas las sequéncias de proteïnas son telecargadas dempuèi UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Proteïna-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) foguèt utilizat per construire un modèl d'omologia de RC, que conten las sequéncias de proteïnas de RC-L, RC-M e RC-H e l'estructura cristallina de Rba. sphaeroides RC foguèt utilizat coma modèl (PDB ID: 5LSE) (46). Utilizatz l'aisina "mapa d'ajustament" dins UCSF Chimera per ajustar lo modèl generat a la mapa (47), melhorar l'estructura de la proteïna, e cofactor [4×BChl a (nom de residu de la bibliotèca de monomèrs = BCL), 2×BPh a (BPH), una o doas menas d'UQ10 (U10), un fèrre non-ème (Fe) e un 34-hexadicolina (QAK)] utilizatz Coot (48) per apondre. Coma QAK es pas disponible dins la bibliotèca de monomèrs, foguèt parametrizat en utilizant l'aisina eLBOW dins PHENIX (49).
Puèi, la sosunitat LH1 foguèt bastida. Inicialament, l'aisina de construccion automatica dins PHENIX (49) foguèt utilizada per bastir automaticament una partida de la sequéncia LH1 en utilizant la mapa e las sequéncias de proteïnas LH1-α e LH1-β coma entrada. Seleccionatz la sosunitat LH1 mai completa, l'extraissètz e la cargatz dins Coot, apondètz manualament la sequéncia mancanta, e afinatz manualament l'estructura entièra abans d'apondre dos BCls a (BCL) e una espiriloxantina (CRT) [segon los Rps pertinents La densitat del complèxe LH1 e lo contengut de carotenoïdes conegut. Espècia (17)]. Copiatz la sosunitat LH1 completa, e utilizatz l'"Docking Map Tool" de la quimèra UCSF per s'acoblar dins l'airal non-modèl adjacent de la densitat LH1, e puèi l'afinar dins Coot; repetir lo procès fins que totas las sosunitats LH1 sián estadas modelizadas. Per l'estructura RC-LH114-W, en extrasent la densitat non assignada dins lo Coot, la proteïna es segmentada dels compausants non proteïcs restants dins la mapa Quimera USCF e l'aisina Autobuild es utilizada per establir lo modèl inicial, e las sosunitats restantas (proteïna-W) Modeling. A PHENIX (49). Apondètz totas las sequéncias mancantas al modèl resultant dins Coot (48), e puèi afinatz manualament tota la sosunitat. La densitat non assignada restanta s'adapta a la combinason de lipids (ID de bibliotèca de monomèrs PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL e POPG = PGT), de moleculas de detergent β-DDM (LMT) e UQ10 (U10). Utilizatz l'optimizacion PHENIX (49) e l'optimizacion manuala dins Coot (48) per perfeccionar lo modèl inicial complet fins que las estatisticas del modèl e la qualitat visuala de l'ajustament pòdon pas èsser melhoradas mai. Fin finala, utilizatz LocScale (50) per afinar la mapa locala, e puèi realizatz divèrses autres cicles de modelizacion de la densitat non assignada e d'optimizacion automatica e manuala.
Los peptides, cofactors e d'autres lipids e quinònas respectius atracats dins lors densitats respectivas son mostrats dins las figuras 1 e 2. S18 a S23. L'informacion estatistica del modèl final es mostrada dins lo tablèu S1.
Levat se s'especifica lo contrari, los espectres d'absorpcion UV/Vis/NIR foguèron collectats sus un espectrofotomètre Cary60 (Agilent, USA) a d'intervals de 1 nm de 250 nm a 1000 nm e un temps d'integracion de 0,1s.
Diluir la mòstra dins una cuveta de quars amb un camin de 2 mm cap a A880 de 1, e reculhir l'espèctre d'absorpcion entre 400 e 1000 nm. Los espectres dicroïcs circulars foguèron collectats sus un espectropolarimètre Jasco 810 (Jasco, Japon) a d'intervals de 1 nm entre 400 nm e 950 nm a una velocitat d'escanatge de 20 nm min-1.
Lo coeficient d'extincion molara es determinat en diluent lo complèxe de nuclèu a un A880 d'aperaquí 50. Diluir lo volum de 10μl dins de tampon de ligason o metanòl de 990μl, e reculhir l'espèctre d'absorpcion immediatament per minimizar la degradacion de BChl. Lo contengut de BChl de cada mòstra de metanòl foguèt calculat pel coeficient d'extincion a 771 nm de 54,8 mM-1 cm-1, e lo coeficient d'extincion foguèt determinat (51). Dividissètz la concentracion de BChl mesurada per 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) per determinar la concentracion del complèxe de còr, qu'es alara utilizada per determinar l'espèctre d'absorpcion del meteis mòstra collectat dins lo coeficient d'extincion del tampon. parallèl. Tres mesuras repetidas foguèron presas per cada mòstra, e l'absorbança mejana del maximum BChl Qy foguèt utilizada pel calcul. Lo coeficient d'extincion de RC-LH114-W mesurat a 878 nm es de 3280±140 mM-1 cm-1, del temps que lo coeficient d'extincion de RC-LH116 mesurat a 880 nm es de 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 foguèt quantificat segon lo metòde de (52). En resumit, la HPLC de fasa invèrsa (RP-HPLC) foguèt realizada en utilizant lo sistèma HPLC Agilent 1200. Dissòlvre aperaquí 0,02 nmol de RC-LH116 o RC-LH114-W dins 50μl de 50:50 metanòl:clorofòrm que conten 0,02% (p/v) de clorur ferric, e injectar l'ultrasfèra Beckman Coulter preequilibrada ODS 4 mml a 1-1-1-m. 40°C dins un solvent HPLC (80:20 metanòl:2-propanòl) sus una colomna de ×25 cm. Realizar l'elucion isocratica dins un solvent HPLC per susvelhar l'absorbància a 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoïdes) e 780 nm (BChl) pendent 1 ora. Lo pic dins lo cromatograma de 275 nm a 25,5 minutas foguèt integrat, que conteniá pas cap d'autres compausats detectables. L'airal integrat es utilizat per calcular la quantitat molara d'UQ10 extracha en referéncia a la corba d'etalonatge calculada a partir de l'injeccion d'estandards purs de 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Cada mòstra foguèt analizada en tres replicas, e l'error reportada correspond a l'SD de la mejana.
Una solucion contenent lo complèxe RC-LH1 amb una absorpcion Qy maximala de 0,1 foguèt preparada amb 30 μM de citocròm c2 de còr de caval redusit (Merck, Reialme Unit) e 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Reialme Unit). Tres mòstras de 1 ml foguèron preparadas a cada concentracion d'UQ2 e incubadas tota la nuèch dins l'escur a 4°C per assegurar una adaptacion completa a l'escur abans la mesura. La solucion foguèt cargada dins un espectrofotomètre modular OLIS RSM1000 equipat d'una grasilha de flama de 300 nm/linha de 500, d'entrada de 1,24 mm, de fendasclas de mièg de 0,12 mm e de sortida de 0,6 mm. Un filtre de passatge de 600 nm es plaçat a l'intrada del fototub de mòstra e del tub fotomultiplicator de referéncia per exclure la lutz d'excitacion. L'absorbància foguèt susvelhada a 550 nm amb un temps d'integracion de 0,15 s. La lutz d'excitacion es emesa del LED M880F2 de 880 nm (diòde emissor de lutz) (Thorlabs Ltd., Reialme Unit) a travèrs un cable de fibra optica a 90% d'intensitat a travèrs un contrarotlador DC2200 (Thorlabs Ltd., Reialme Unit) e es emesa a la font de lutz a un angle de 90° de font. Lo fais de mesura es opausat al miralh per tornar tota lutz qu'èra pas inicialament absorbida per la mòstra. Susvelhar l'absorbància 10 s abans l'esclairatge de 50 s. Puèi l'absorbància foguèt mai susvelhada pendent 60 s dins l'escur per avalorar la mesura que lo quinolòl redusís espontanèament lo citocròm c23 + (veire la Figura S8 per de donadas brutas).
Las donadas foguèron tractadas en ajustant un taus inicial linear dins 0,5 a 10 s (segon la concentracion d'UQ2) e en fasent una mejana dels tausses dels tres mòstras a cada concentracion d'UQ2. La concentracion RC-LH1 calculada pel coeficient d'extincion respectiu foguèt utilizada per convertir lo taus en eficiéncia catalitica, traçada dins Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), e ajustada al modèl Michaelis-Menten per determinar las valors Km e Kcat aparentas.
Per de mesuras d'absorpcion transitòria, lo mòstra RC-LH1 foguèt diluit a ~2μM dins un tampon IMAC contenent 50 mM d'ascorbat de sòdi (Merck, USA) e 0,4 mM de Terbutina (Merck, USA). L'acid ascòrbic es utilizat coma donaire d'electrons sacrificial, e lo tert-butaclofen es utilizat coma inhibitor QB per s'assegurar que lo donaire principal de RC demòra redusit (es a dire, pas fotooxidat) pendent tot lo procès de mesura. Aperaquí 3 ml de mòstra son aponduts a una cellula rotativa personalizada (aperaquí 0,1 m de diamètre, 350 RPM) amb una longor de camin optic de 2 mm per s'assegurar que la mòstra dins lo camin laser a pro de temps per l'adaptacion escur entre los impulses d'excitacion. Utilizar d'impulsions laser de ~100-fs per amplificar lo sistèma laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) per excitar la mòstra a 880 nm a un taus de repeticion de 1 kHz (20 nJ per NIR o 100 nJ per Vis). Abans de collectar de donadas, expausatz la mòstra a la lutz d'excitacion pendent aperaquí 30 minutas. L'exposicion provocarà l'inactivacion de l'AQ (benlèu en redusent l'AQ un o dos còps). Mas mercés de notar qu'aqueste procès es reversible perque après un long periòde d'adaptacion escur, RC tornarà lentament a l'activitat de QA. Un espectromètre Helios (Ultrafast Systems, USA) foguèt utilizat per mesurar d'espèctres transitòris amb un temps de retard de -10 a 7000 ps. Utilizatz lo logicial Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) per desgropar los ensembles de donadas, puèi fusionar e estandardizar. Utilizatz lo paquet logicial CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) per utilizar l'ensemble de donadas combinat per obténer d'espèctres diferencials ligats a la decadéncia, o utilizatz una foncion que convolve d'exponents multiples amb la responsa de l'instrument per s'adaptar a l'evolucion espectrala de longor d'onda unica dins Origin (OriginLab, USA).
Coma mencionat çai-sus (53), un filme fotosintetic contenent un complèxe LH1 mancant a l'encòp d'antena RC e d'antena LH2 periferica foguèt preparat. La membrana foguèt diluida dins 20 mM tris (pH 8,0) e puèi cargada dins una cuveta de quars amb un camin optic de 2 mm. Un pols laser de 30nJ foguèt utilizat per excitar la mòstra a 540 nm amb un temps de retard de -10 a 7000 ps. Tractatz l'ensemble de donadas coma descrich per Rps. mòstra pal.
La membrana foguèt pelletizada per centrifugacion a 150 000 RCF pendent 2 oras a 4°C, e puèi son absorbància a 880 nm foguèt resuspenduda dins 20 mM tris-HCl (pH 8,0) e 200 mM NaCl. Dissòlvre la membrana en remenant lentament dins 2% (p/v) β-DDM pendent 1 ora dins l'escur a 4°C. La mòstra foguèt diluida dins 100 mM de carbonat de trietilamòni (pH 8,0) (TEAB; Merck, Reialme Unit) a una concentracion de proteïna de 2,5 mg ml-1 (analisi Bio-Rad). Un tractament suplementari foguèt realizat a partir del metòde publicat prèviament (54), en començant per la dilucion de 50 μg de proteïna dins un total de 50 μl de TEAB contenent 1% (p/v) de laurat de sòdi (Merck, Reialme Unit). Après sonicacion pendent 60 s, foguèt redusit amb 5 mM de tris(2-carboxetil)fosfina (Merck, Reialme Unit) a 37°C pendent 30 minutas. Per l'alquilacion S, incubatz la mòstra amb 10 mM de metil S-metiltiometanosulfonat (Merck, Reialme Unit) e l'apondretz a partir d'una solucion d'isopropanòl de 200 mM pendent 10 minutas a temperatura ambienta. La digestion proteolitica foguèt realizada en apondent 2 μg de mescla tripsina/endoproteinasa Lys-C (Promega UK) e incubada a 37°C pendent 3 oras. Lo tensioactiu laurat foguèt extrach en apondent 50 μl d'acetat d'etil e 10 μl d'acid trifluoroacetic de gra LC 10% (v/v) (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) e en vortexant pendent 60 s. La separacion de fasa foguèt promoguda per centrifugacion a 15 700 RCF pendent 5 minutas. Segon lo protocòl del fabricant, una colomna de spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Reialme Unit) foguèt utilizada per aspirar e desalenar amb precaucion la fasa inferiora que conten lo peptid. Après secatge per centrifugacion al vuèg, lo mòstra foguèt dissolgut dins 0,5% TFA e 3% acetonitril, e 500 ng foguèron analizats per cromatografia RP de nanoflux acoblada a l'espectrometria de massa en utilizant los paramètres del sistèma detalhats prèviament.
Utilizatz MaxQuant v.1.5.3.30 (56) per l'identificacion e la quantificacion de las proteïnas per cercar Rps. basa de donadas de proteòma palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Las donadas de proteomica d'espectrometria de massa son estadas depausadas dins l'Aliança ProteomeXchange a travèrs lo depaus partenari PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) jos l'identificant de l'ensemble de donadas PXD020402.
Per l'analisi per RPLC acoblat a l'espectrometria de massa d'ionizacion per electropulverizacion, lo complèxe RC-LH1 foguèt preparat a partir de Rps de tipe salvatge. En utilizant lo metòde publicat prèviament (16), la concentracion de proteïna produsida dins de cellulas palustris èra de 2 mg ml-1 dins 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl e 0,03% (p/v) β- (analisi Bio-Rad) ) DDM. Segon lo protocòl del fabricant, utilizatz lo kit de purificacion 2D (GE Healthcare, USA) per extraire 10 μg de proteïna per metòde de precipitacion, e dissòlv lo precipitat dins 20 μl 60% (v / v) d'acid formic (FA), 20% (v / v) d'acetonitril e 20% (v/v) d'aiga. Cinc microlitres foguèron analizats per RPLC (Dionex RSLC) acoblat a l'espectrometria de massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Utilizatz la colomna MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) per la separacion a 60°C e 100μlmin -1, amb un gradient de 85% (v / v) solvent A [0,1% (v / v) FA e 0,02% (V/v) TFA solucion aquosa] a 85% (v / v) solvent Bv/v) [0,1%(v/v) FA e 0,02%(v/v) dins 90%(v/v) acetonitril TFA] En utilizant la font d'ionizacion d'electropulverizacion estandard e los paramètres per defaut pendent mai de 60 minutas, l'espectromètre de massa obten de 100 a 2750 m/z (rapòrt de carga de massa). Amb l'ajuda de l'aisina FindPept del portal de ressorsas de bioinformatica ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapatz l'espèctre de massa a las sosunitats del complèxe.
Las cellulas foguèron cultivadas pendent 72 oras jos 100 ml de lutz NF-bassa (10μMm-2 s-1), mejana (30μMm-2 s-1) o nauta (300μMm-2 s-1). Mitan M22 (mitan M22 que lo sulfat d'amoni es omis e que lo succinat de sòdi es remplaçat per l'acetat de sòdi) dins una botelha de 100 ml a vis (23). Dins cinc cicles de 30 s, de perlas de veire de 0,1 micron foguèron perladas a un rapòrt de volum de 1:1 per lisar las cellulas e refregidas sus glaç pendent 5 minutas. La matèria insolubla, las cellulas non trencadas e las granas de veire foguèron levadas per centrifugacion a 16 000 RCF pendent 10 minutas dins una microcentrifuga de taulièr. La membrana foguèt separada dins un rotor Ti 70.1 amb 100 000 RCF dins 20 mM tris-HCl (pH 8.0) amb un gradient de sacarosa 40/15% (p/p) pendent 10 oras.
Coma descrich dins nòstre trabalh precedent, l'immunodeteccion de l'etiqueta His sus PufW (16). En resumit, lo complèxe de nuclèu purificat (11,8 nM) o la membrana que conten la meteissa concentracion de RC (determinada per l'oxidacion en restant l'espèctre de diferéncia redusida e en correspondent a la carga sul gel colorat) dins un tampon de cargament SDS 2x (Merck, Reialme Unit) diluit dos còps. Las proteïnas foguèron separadas sus un gel NuPage bis-tris de rèplica de 12% (Thermo Fisher Scientific, Reialme Unit). Un gel foguèt colorat amb Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Reialme Unit) per cargar e visualizar la sosunitat RC-L. La proteïna sul segond gel foguèt transferida a la membrana de fluor de polivinilidèn activat per metanòl (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Reialme Unit) per l'immunoassaig. La membrana PVDF foguèt blocada dins 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v / v) Tween-20 e 5% (p / v) de lach en polvera desnatada, e puèi incubada amb l'anticòrs primari anti-His (dins Diluir l'anticòrs tris-HCl [50 mM) 7.6), 150 mM NaCl e 0.05% (v/v) Tween-20] dins 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) pendent 4 oras. Après un lavatge 3 còps pendent 5 minutas dins un tampon d'anticòrs, la membrana foguèt combinada amb d'anticòrs segondari anti-rat peròxidasa de ravan (Sigma-Aldrich, Reialme Unit) (diluit 1:10 000 dins un tampon d'anticòrs) Incubar per permetre la deteccion (5 minutas après 3 lavatges dins un tampon d'anticòrs) en utilizant WAR 2000. substrat de quimioluminescéncia (Cyanagen, Itàlia) e Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reialme Unit).
En dessenhant la distribucion d'intensitat de cada via de gel colorat o d'immunoassaig, en integrant l'airal jos lo pic e en calculant lo rapòrt d'intensitat de RC-L (gel colorat) e de Proteïna-W (immunoassaig), dins ImageJ (57) Tractatz l'imatge. Aquestes rapòrts foguèron convertits en rapòrts molars en supausant que lo rapòrt de RC-L a proteïna-W dins lo mòstra RC-LH114-W pur èra 1:1 e en normalizant l'ensemble de donadas en consequéncia.
Per de materials suplementaris per aqueste article, mercés de consultar http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Aquò's un article d'accès dobèrt distribuit jos las condicions de la Licéncia d'Atribucion Creative Commons. L'article permet un usatge, la distribucion e la reproduccion sens restriccions dins quin mejan que siá a la condicion que l'òbra originala siá corrèctament citada.
Nòta : Vos demandam pas que de provesir vòstra adreça de corrièl per que la persona que recomandatz a la pagina sàpia que volètz que veja lo corrièl e qu'es pas de spam. Capturarem pas cap d'adreça de corrièl.
Aquesta question es utilizada per testar se sètz un visitor e evitar la somission automatica de spam.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Andrew C. Necoilter Hunter.
L'estructura de nauta resolucion del complèxe trapèla de lutz 1 dins lo centre de reaccion provesís de novèlas coneissenças sus la dinamica de la quinona.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Andrew C. Necoilter Hunter.
L'estructura de nauta resolucion del complèxe trapèla de lutz 1 dins lo centre de reaccion provesís de novèlas coneissenças sus la dinamica de la quinona.
©2021 Associacion Americana per l'Avançament de la Sciéncia. totes los dreches reservats. AAAS es un socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.